豬戊型肝炎病毒swCH189株衣殼蛋白基因CP239片段原核表達條件的優化

摘要：為了提高豬戊型肝炎病毒ｓｗＣＨ１８９株衣殼蛋白基因ＣＰ２３９片段在大腸桿菌中的表達量，研究了載體、溫度、轉速、誘導時間以及誘導劑ＩＰＴＧ濃度等不同條件對衣殼蛋白基因ＣＰ２３９片段融合蛋白表達量的影響。結果表明，用ＬＢ培養基于３７ ℃培養３．５ ｈ后，采用終濃度為０．３ ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ在３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ誘導培養４ ｈ，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白表達量最大；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測結果表明ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白的分子質量與預期大小一致，約為４５．３ ｋｕ；Ｗｅｓｔｅｒｎ blotting結果表明，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白可以與抗－ＨＥＶ陽性血清發生特異性反應，并具有良好的反應原性，說明衣殼蛋白基因ＣＰ２３９片段蛋白得到正確表達。

關鍵詞：豬戊型肝炎病毒；衣殼蛋白；ＣＰ２３９片段；原核表達

中圖分類號：Ｑ７８６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3116-04

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｎｅ ＣＰ２３９ ｉｎ ｔｈｅ ｓｗＣＨ１８９ Ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Vｉｒｕｓ

ＨＡＯ Ｂａｏ－ｃｈｅｎｇ１，２，ＬＩＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ１，３，ＬＡＮ Ｘｉ２，ＸＩＮＧ Ｘｉａｏ－ｙｏｎｇ３，ＸＩＡＮＧ Ｈａｉ－ｔａｏ３，ＷＥＮ Ｆｅｎｇ－ｑｉｎ３，

ＨＵ Ｙｏｎｇ－ｈａｏ３，ＬＩＵ Ｊｉ－ｘｉｎｇ２，３

（１． Ｌａｎｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｉｍａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｊｅｃｔ／Ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｉｍａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００５０，Ｃｈｉｎａ；２． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌａｎｚｈｏｕ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ／Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｃｕｓｅｄ ｏｎ ｐｌａｎｔ－ｅａｔｉｎｇ ａｎｉｍａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｎ Ｌａｎｚｈｏｕ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００４６， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： To improve ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｇｅｎｅｓ ＣＰ２３９ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ ｓｗＣＨ１８９ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．， ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｒｏｔａｔｉｎｇ ｓｐｅｅｄ， ｉｎｄｕｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ was ａｎａｌｙｓｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９ ｗａｓ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ３．５ ｈ ｗｉｔｈ ＬＢ ａｔ ３７ ℃ ａｎｄ ４ ｈ ｉｎｄｕｃｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ ａｔ ３７ ℃，２００ ｒ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ４５．３ ｋｕ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ Ａｎｔｉ－ＨＥＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｗｉｔｈ ｗｅｌｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ＣＰ２３９ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗａｓ ｐｒｏｐｅｒｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．

Ｋｅｙ wｏｒｄｓ： sｗｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ； cａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＣＰ２３９ ｆｒａｇｍｅｎｔ； pｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

戊型肝炎病毒（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ，ＨＥＶ）過去曾被認為是一種經腸道傳播的非甲非乙型肝炎病毒。Ｂａｌａｇａｎ等［１］用免疫電鏡技術從一名志愿受試者糞便中觀察到直徑為２７～３０ ｎｍ的病毒樣顆粒，從而證實該病毒為新型的肝炎病毒，并對人類健康具有嚴重的危害性。ＨＥＶ基因組為單股正鏈ＲＮＡ，約７．３ ｋｂ，具有３個開放讀碼框（ＯＲＦ）。病毒基因組的５′端到３′端依次為５′端非編碼區、ＯＲＦ１、ＯＲＦ３、ＯＲＦ２、３′端非編碼區及ｐｏｌｙＡ 尾。

ＨＥＶ ＯＲＦ２編碼蛋白（ＰＯＲＦ２）抗原表位數量多，結構復雜，除Ｎ端２５－３８ ａａ外，大多數分布在Ｃ端２／３部分，包括了ＰＯＲＦ２ ２５－３８ ａａ、３１９－３４０ ａａ、３４１－３５４ ａａ、３９０－４７０ ａａ、４２２－４３７ ａａ、５１７－５３０ ａａ、５４６－５８０ ａａ、６３１－６４８ ａａ、６４１－６６０ ａａ等９個抗原活性區，研究還證實在３９４－４７０ ａａ之間至少含有５個不同免疫活性的抗原表位［２－４］。本試驗利用ｐｒｏｔｅａｎ軟件對ＨＥＶ ｓｗＣＨ１８９株的ＯＲＦ２進行潛在抗原位點分析。在ＯＲＦ２ Ｃ端２／３處選取ＣＰ２３９片段（３８１－６２３ ａａ）進行了原核表達，在克隆和表達了ＣＰ２３９片段的基礎上對其表達條件進行了優化，以期獲得最大產量的融合蛋白用于建立快速診斷方法。

１材料與方法

１．１病毒株

經ＲＴ－ＰＣＲ檢測ＨＥＶ ＲＮＡ為陽性的ｓｗＣＨ１８９株，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所傳染病實驗室保存。

１．２菌種和載體

菌種為大腸桿菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，表達菌Rｏｓｅｔｔａ及表達載體ｐＥＴ２８ａ（＋）、ｐＥＴ３２ａ（＋）由中國農業科學院蘭州獸醫研究所傳染病實驗室保存。克隆載體ｐＭＤ１８－Ｔ載體購自大連寶生物工程公司。

１．３試劑

辣根過氧化物酶標記的羊抗豬ＩｇＧ抗體、ＤＡＢ為鵬程公司產品。ＲＮａｓｅ、低分子蛋白質Ｍａｒｋｅｒ、瓊脂糖購自聯創公司。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 蛋白Ｍａｒｋer購自鵬程公司。其余試劑均為分析純或生化試劑。

１．４融合蛋白的誘導表達

含ＣＰ２３９基因的重組質粒ｐＥＴ２８ａ－ＣＰ２３９、ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９和ｐＥＴ２８ａ、ｐＥＴ３２ａ空載體分別導入表達受體菌Ｒｏｓｅｔｔａ中，挑取單菌落于３７ ℃培養至ＯＤ６００nm≈０．６，加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導一定時間，并以空菌、空載體和未加ＩＰＴＧ的培養物作為對照；菌體離心后棄上清液，沉淀重懸于１０ ｍＬ含２％ ＤＯＣ的細菌裂解液，振蕩混勻，室溫放置１５ ｍｉｎ，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ。取沉淀再重復上述步驟２次，上清液均留樣。使用最小體積的４ mol/L的尿素將沉淀溶解，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ。沉淀中若仍有透明未溶解物質，再用８ mol/L的尿素溶解，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，棄沉淀。重懸后加入２倍ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上樣緩沖液混勻，沸水煮５ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ/ｍｉｎ離心１ ｍｉｎ后取上清液進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測，鑒定目的基因的表達情況。

１．５融合蛋白的鑒定

Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌotting鑒定融合蛋白，即樣品經１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離后，按Ｂｉｏ．Ｒａｄ濕轉使用說明將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，２００ ｍＡ，１０５ ｍｉｎ完成濕轉。用５％牛血清３７ ℃封閉液室溫封閉２ ｈ。將硝酸纖維素膜放入干凈的塑料袋中，加用封閉液稀釋的人抗－ＨＥＶ陽性血清（１ ０００倍稀釋），封閉塑料袋，室溫搖擺平臺過夜。１００ ｍＬ ＰＢＳＴ洗膜５次，每次１５ ｍｉｎ。加入用封閉液以１ ０００倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗豬ＩｇＧ抗體，室溫溫育２ ｈ。１００ ｍＬ ＰＢＳＴ洗膜５次，每次１５ ｍｉｎ，ＡＥＣ（３－氨基－９－乙基卡唑，３－ａｍｉｎｏ－９－ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｚｏｌｅ）顯色１５ ｍｉｎ，用濾紙吸干膜上殘余液體，拍照保存。

２結果與分析

２．１不同表達載體對ＣＰ２３９表達量的影響

分別將ｐＥＴ２８ａ－ＣＰ２３９、ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９的重組菌１％接種于含氨芐西林抗性的ＬＢ培養基中，３７ ℃ 搖床培養３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入終濃度為１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，３７ ℃誘導培養４ ｈ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 檢測結果表明ｐＥＴ３２ａ中ＣＰ２３９表達量較高， ｐＥＴ２８ａ中表達量較低，因此ｐＥＴ３２ａ是比較適合ＣＰ２３９表達的載體。

２．２溫度對重組菌生長和ｐＥＴ３２a－ＣＰ２３９表達量的影響

重組菌１％ 接種于含氨芐西林抗性的ＬＢ培養基中，３７ ℃培養３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入終濃度為１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，分別在２２、３０、３７ ℃誘導培養４ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測結果表明，３７ ℃時ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表達量最高，30 ℃時表達量稍低，而在２2 ℃時表達量更低。

２．３轉速對重組菌生長和ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表達量的影響

重組菌１％接種于含氨芐西林抗性的ＬＢ培養基中，３７ ℃培養３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入終濃度為１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ， 分別在３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ和３７ ℃、１００ ｒ／ｍｉｎ誘導培養４ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 檢測結果表明，轉速對ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９的影響很大，３７ ℃、１００ ｒ／ｍｉｎ誘導培養條件下ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表達量較低。

２．４ＩＰＴＧ使用濃度對重組菌生長和ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表達量的影響

ＩＰＴＧ是重組菌表達目的蛋白的誘導劑，將重組菌１％的接種量接種于含氨芐西林抗性的ＬＢ培養基中，３７ ℃培養３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，分別加入不同終濃度的ＩＰＴＧ（０．１、０．３、０．５、０．７、１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ）誘導表達。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測結果表明，ＩＰＴＧ對ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白的表達量有明顯影響，加ＩＰＴＧ前基本不表達； 在濃度小于０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ時表達量較小，在濃度等于０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ時能完全表達，在濃度大于０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ時也能完全表達，因此，在濃度為０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ時，表達最優（圖１）。

２．５ＩＰＴＧ誘導時間對ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表達量的影響

重組菌１％ 接種于含氨芐西林抗性的ＬＢ培養基中，３７ ℃培養３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入終濃度為１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，誘導時間分別從１ ｈ至８ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳結果表明，ＩＰＴＧ誘導培養４ ｈ時ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白的表達量較高，大于４ ｈ后表達量已沒有明顯差別。

２．６Ｗｅｓｔｅｒｎ blotting鑒定結果

在優化條件下，將含重組質粒ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９ 的大腸桿菌菌株Ｒｏｓｅｔｔａ在３７ ℃培養３．５ ｈ后，使用終濃度為１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ在３７ ℃誘導培養４ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測結果表明，融合后的目的蛋白為單一條帶，大小約為４５．３ ｋｕ，與預計的分子質量大小相符合（圖２）；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂlotting結果表明，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白可以與抗－ＨＥＶ陽性血清發生特異性反應，并具有良好的反應原性。

３討論

大腸桿菌是第一個用于重組蛋白生產的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養操作簡單、轉化和轉導效率高、生長繁殖快、成本低廉，可以快速大規模地生產目的蛋白等優點［５］，而且其表達外源基因產物的水平遠高于其他基因表達系統，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的３０％，因此大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白質表達系統［６］。

目前人們運用基因工程技術已在大腸桿菌中成功地表達了許多重要的生物活性蛋白基因，但是由于目的基因結構的多樣性及其與大腸桿菌基因的差異，不同的外源基因在表達效率上有很大的差異。表達系統的核心是表達載體。用來在大腸桿菌中表達外源基因的載體有很多種，一般來說，這些載體應滿足以下要求：重組質?？截悢刀啵磉_量高；適用范圍廣；表達產物容易純化；在菌體內穩定性好。不同載體的特點不同，主要的差別有啟動子類型、質粒拷貝數、基因本身的因素、密碼子的偏愛性等，宿主菌的特點也很重要，融合表達策略也有利于順利表達外源蛋白。這些就決定了對某一個特定的基因而言，并非所有的表達載體都適合。因此在本試驗中，通過不同表達載體與宿主菌﹑培養條件適宜的組合來使目的蛋白獲得最大量的表達。

從實驗結果看溫度對目的蛋白表達量的高低影響較小。試驗選擇３７ ℃作為誘導溫度，是因為目的基因在低溫時表達稍低，在高溫時又常常會使一些蛋白積累形成包涵體［７］。誘導溫度對表達量有影響，主要體現在對宿主后續生長的影響上。

異丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而且十分穩定，因此ＩＰＴＧ是實驗室常用的乳糖操縱子誘導劑，能與ｌａｃ?譙編碼的阻遏蛋白特異性結合，使阻遏蛋白構象發生變化，從而誘導Ｔ７啟動子驅動重組基因的轉錄和表達，是一種十分有效的誘導劑［８］。Ｆａｓｓ等［９］早在１９９１年的研究表明ＩＰＴＧ的劑量有一定范圍，濃度過低影響目的蛋白的表達，濃度過高則抑制細菌的生長，在培養基中少量存在時就可進入菌體內部發揮作用，是一種非代謝的誘導物。試驗采用ＩＰＴＧ作誘導劑，從圖１可以看出，ＩＰＴＧ對基因的表達有關鍵性的影響。與誘導前相比，加入ＩＰＴＧ后目的基因表達條帶明顯增加，但不同終濃度ＩＰＴＧ對融合蛋白的表達量影響較小。當ＩＰＴＧ濃度增加到１ ｍｍｏｌ／Ｌ時，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９蛋白的表達量較大，繼續增加ＩＰＴＧ的濃度，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９蛋白的表達量不增加反而略有下降，這可能是由于較高濃度的乳糖提高了細菌的生長速度，當細菌過快生長時，質粒的拷貝數降低，導致表達量下降。在本試驗中ＩＰＴＧ誘導表達的最佳終濃度為０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ。

誘導時間對蛋白表達量有一定影響，誘導時間太短，菌體量少，目的蛋白量也少；誘導時間太長，則菌體老化，酶體系統活性減弱，代謝速度減慢，轉錄翻譯遲鈍，不利于目的蛋白的表達。從試驗中發現，３７ ℃誘導４ ｈ時ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９蛋白的表達量最大，誘導時間過短蛋白表達量稍低，誘導時間過長，表達量已經恒定，延長時間表達已沒有意義，且誘導時間達７ ｈ以上時，蛋白的表達量反而降低。原因可能是由于細菌生長接近飽和而老齡菌體增加所致，有研究報道如果再更換等體積新鮮培養基誘導或可獲得更高的蛋白表達量［１０］。

參考文獻：

［１］ ＢＡＬＡＹＡＮ Ｍ Ｓ， ＡＮＤＪＡＰＡＲＩＤＺＥ Ａ Ｇ， ＳＡＶＩＮＳＫＡＹＡ Ｓ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｎｏｎ－Ａ， ｎｏｎ－Ｂ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｖｉａ ｔｈｅ ｆｅｃａｌ－ｏｒａｌ ｒｏｕｔｅ［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８３，２０（１）：２３－３１．

［２］ ＫＡＵＲ Ｍ，ＨＹＡＭＳ Ｋ Ｃ，ＰＵＲＤＹ Ｍ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｌｉｎｅａｒ Ｂ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｃｌｕｄｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９２，８９（９）：３８５５－３８５８．

［３］ ＫＨＵＤＹＡＫＯＶ Ｙ Ｅ，ＫＨＵＤＹＡＫＯＶＡ Ｎ Ｓ，ＦＩＥＬＤＳ Ｈ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ，１９９３，１９４（１）：８９－９６．

［４］ ＫＨＵＤＹＡＫＯＶ ＹＵ Ｅ，ＦＡＶＯＲＯＶ Ｍ Ｏ，ＪＵＥ Ｄ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ pｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ，１９９４，１９８（ｌ）：３９０－３９３

［５］ ＮＵＣ Ｐ， ＮＵＣ Ｋ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］ ． Ｐｏｓｔｅｐｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００６，５２（４）：４４８－４５６．

［６］ ＤＯＮＧ Ｘ， ＴＡＮＧ Ｂ， ＬＩ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ pｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ iｎｔａｃｔ ａｎｄ fｕｎｃｔｉｏｎａｌ sｏｙｂｅａｎ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ） sｅｅｄ fｅｒｒｉｔｉｎ cｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］． Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００８，１８（２）：２９９－３０７．

［７］ 魏巍，劉璇，黃小國，等． 豬瘟病毒囊膜糖蛋白Ｅ２ 的原核表達及重組蛋白ＥＬＩＳＡ 應用［Ｊ］． 畜牧與獸醫，２００８，４０（６）：７０－７２．

［８］ 楊書慧，趙勝軍，劉軍，等． 乳糖誘導甜蛋白Ｍｏｎｅｌｌｉｎ在大腸桿菌中的表達［Ｊ］． 中國生物工程雜志，２００８，２８（３）：５３－５８．

［９］ ＦＡＳＳ Ｒ， ＶＡＮ ＤＥ ＷＡＬＬＥ Ｍ， ＳＨＩＬＯＡＣＨ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，３６（１）：６５－６９．

［１０］ 王秋霞，張美英，張改平，等． 豬囊尾蚴排泄分泌抗原Ｔｓ８Ｂ１蛋白原核表達條件的優化［Ｊ］． 華北農學報，２００９，２４ （３）：５９－６３．