受褐飛虱誘導的水稻酵母雙雜交文庫的構建

摘要：為了研究水稻抗褐飛虱的分子機制，構建了受褐飛虱取食誘導的水稻的酵母雙雜交文庫。檢測結果表明構建的文庫容量為２．２２×１０６ CFU，文庫滴度為５．４×１０７ CFU／ｍＬ，文庫ｃＤＮＡ插入片段長度主要分布在７００～１ ０００ ｂｐ之間。

關鍵詞：褐飛虱；水稻；酵母雙雜交文庫

中圖分類號：Ｑ８１２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3201-03

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｒｉｃｅ Ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｂｒｏｗｎ Ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ

ＺＨＵ Ｌｉ－ｌｉ，ＨＵ Ｌｉａｎｇ，ＤＵ Ｂｏ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｉｃｅ ｔｏ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ， ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｒｉｃｅ ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｓｅｃｔ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ２．２２×１０６ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｅｓ； ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｗｅｒｅ ５．４×１０７ CFU／ｍＬ． Ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｍｏｓｔ ｉｎｓｅｒｔｓ ｗｅｒｅ ７００～１ ０００ ｂｐ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｂｒａｒｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ； ｒｉｃｅ； ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｌｉｂｒａｒｙ

褐飛虱（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ Ｓｔ?覽ｌ．，ＢＰＨ）是對水稻危害最嚴重的害蟲之一，嚴重威脅水稻的高產和穩產［１］。在水稻生產中，依靠化學殺蟲劑防治褐飛虱不僅可能引起褐飛虱的再猖獗，還會造成環境污染［２］。目前認為，培育并推廣種植抗褐飛虱水稻品種是綜合防治褐飛虱最為經濟有效和環境友好的方法［３］。迄今為止，人們在野生稻和栽培品種中定位了２１個抗褐飛虱的主效基因［４］，并成功地克隆了水稻抗褐飛虱基因Ｂｐｈ１４［５］，但水稻抗褐飛虱的分子機制仍不清楚。近年來，科學家們應用多種方法，如ｃＤＮＡ ａｒｒａｙ、抑制差減雜交、ｃＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒｙ以及ｉＴＲＡＱ技術等，從ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白質水平對抗、感水稻品種受褐飛虱取食誘導后的變化進行了探索［６－９］。這些研究表明，褐飛虱的取食導致了水稻體內與細胞防御、細胞傳遞、大分子代謝、信號傳導等相關的基因和蛋白表達顯著的改變。然而，這些報道都是大范圍地進行水稻抗褐飛虱分子機制的探索。抗褐飛虱相關基因與哪種蛋白相互作用，從而介導抗性反應則完全不清楚。

酵母雙雜交技術是一種研究蛋白質之間相互作用的有效手段，不但可以檢測已知蛋白質之間的相互作用，更重要的在于發現與已知蛋白相互作用的未知蛋白，是一種成熟的研究蛋白間相互作用的方法。本研究構建褐飛虱取食水稻品種９３１１的酵母雙雜交文庫，為篩選抗褐飛虱基因互作蛋白分子，并進一步研究水稻抗褐飛虱的分子機理奠定基礎。

１材料和方法

１．１實驗材料

建庫所用水稻品種為９３１１；所用褐飛虱飼養在武漢大學植物遺傳研究所的水稻品種臺中本地一號（ＴＮ１）上。構建酵母文庫的試劑盒購自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司，ＲＮＡ提取試劑盒購自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ公司。

１．２方法

１．２．１水稻處理將水稻品種９３１１播種于直徑９ ｃｍ的塑料杯中。４葉期時分別于０、３、６、１２、２４、４８、７２、９６ ｈ按每棵苗８頭間隔接入褐飛虱，同一時間終止反應。

１．２．２ＲＮＡ的提取采用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＲＮＡ提取試劑盒提取水稻葉鞘的ＲＮＡ。提取后的ＲＮＡ進行電泳，檢測其質量，并調整ＲＮＡ的量至所有樣品相同。

１．２．３ｃＤＮＡ的合成參照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ試劑盒的說明，先合成ｃＤＮＡ第一鏈，再通過ＰＣＲ擴增雙鏈ｃＤＮＡ，并純化以去除小片段ｃＤＮＡ。

１．２．４酵母感受態細胞的制備按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ試劑盒的說明制備Ｙ１８７感受態細胞，制備好的感受態細胞要立即使用。

１．２．５酵母文庫的轉化按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ試劑盒的要求，將擴增的雙鏈ｃＤＮＡ、線性化的ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ轉入酵母感受態細胞Ｙ１８７。在直徑１５０ ｍｍ的ＳＤ／－Ｌｅｕ培養皿上涂抹１５０ μＬ菌液（共１００個培養皿）。在直徑９０ ｍｍ的ＳＤ／－Ｌｅｕ培養皿上分別涂抹１∶１０，１∶１００和１∶１ ０００的稀釋菌液，以檢測轉化的效率。培養皿在３０ ℃條件下倒置培養３ ｄ至菌落出現。

１．２．６文庫的收集和滴度測定根據按比例稀釋的平板上的克隆數，計算文庫的獨立轉化的克隆：初始文庫獨立克隆子數目（庫容量）＝每塊平板的平均克隆子數目×稀釋倍數×懸浮體積。然后用含有３０％甘油的ＬＢ液體培養基清洗培養基上生長的菌落，全部收集于無菌三角瓶中，共３００ ｍＬ。充分混勻后，用血球計數板進行滴度測定。符合滴度要求，再按每１ ｍＬ分裝至１．５ ｍＬ的ＥＰ管，保存在－８０ ℃。

１．２．７ｃＤＮＡ插入片段大小的檢測隨機挑取平板上生長的單菌落，以ｐＧＡＤＴ７載體通用引物Ｔ７和ＡＤ對其進行ＰＣＲ擴增，電泳檢測ｃＤＮＡ插入片段的大小。

２結果與分析

２．１ＲＮＡ的質量及濃度

用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總ＲＮＡ純度（圖１）。結果顯示：提取的ＲＮＡ含量高，純度好，未發生降解，滿足建庫需要；同時，調整ＲＮＡ樣品的上樣量，使受褐飛虱取食８個時間段的水稻ＲＮＡ樣品量相同。相同質量的ＲＮＡ混合后，反轉錄得到單鏈ｃＤＮＡ。

２．２ｃＤＮＡ合成和純化結果

ｍＲＮＡ反轉錄合成第一鏈后，ＬＤ－ＰＣＲ擴增獲得雙鏈ｃＤＮＡ。取５ μＬ擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定擴增片段的大小符合要求。用試劑盒提供的純化柱進行純化去掉２００ ｂｐ以下的小片段。電泳結果顯示純化后的雙鏈ｃＤＮＡ的大小主要在３００～

３ ０００ ｂｐ之間（圖２）。

２．３文庫的容量與滴度

根據公式計算得知９３１１的初始文庫獨立克隆子數目為２．２２×１０６ CFU；用液體培養基收集后，血球計數板檢測文庫的滴度為５．４×１０７ CFU／ｍＬ。２０多倍的文庫滴度既保證了ｃＤＮＡ文庫的完整性和覆蓋度，也減少了篩庫的工作量。

２．４酵母文庫插入片段大小

隨機挑選２４個文庫轉化子，通過ＰＣＲ反應檢測文庫插入片段大小。從圖３中可以看出：所構建的９３１１酵母文庫中，插入片段大小不等，具有良好的多樣性；插入片段大小主要分布在４００～１ ５００ ｂｐ之間，密集分布在７００～１ ０００ ｂｐ之間，文庫插入片段平均大小約為８８０ ｂｐ。

３討論

用于構建水稻酵母雙雜交文庫的水稻品種是９３１１，其并不具有對褐飛虱的抗性。但是有研究表明通過分子標記輔助選擇將抗褐飛虱基因導入９３１１后，育成的材料具有穩定的抗性［１０，１１］?？紤]到９３１１具有優良的農藝性狀，已測序完成，有可用的基因組序列，且多個抗褐飛虱基因均能在９３１１中發揮作用。所以選擇用受褐飛虱取食誘導的９３１１來構建酵母雙雜交文庫，以用于篩選與抗性相關基因互作的蛋白。

對文庫質量的評價主要體現在兩個方面。一方面為文庫的代表性，指文庫中包含的重組ｃＤＮＡ分子反映來源組織中表達信息（即ｍＲＮＡ種類）的完整性，其好壞可用文庫的庫容量來表示，指構建的初始ｃＤＮＡ文庫中所包含的獨立的重組子克隆數。庫容量取決于來源組織中所表達的ｍＲＮＡ種類和每種ｍＲＮＡ的拷貝數。因此，ＲＮＡ的提取是ｃＤＮＡ合成和文庫構建過程中最為關鍵的一步。本研究嚴格按照試劑盒說明抽提并純化ｍＲＮＡ，通過質量評價確定所提取的ＲＮＡ產量高、純度好，未發生降解，且調整濃度至所有樣品量一致。測定酵母文庫的庫容量大于１×１０６ CFU，保證了文庫的完整性和覆蓋度。文庫質量評價的另一個方面是重組ｃＤＮＡ片段的序列完整性。本研究在合成ｃＤＮＡ的過程中，盡可能保證ｃＤＮＡ序列的完整性。對構建的文庫ｃＤＮＡ插入片段ＰＣＲ結果分析表明，插入片段大小主要分布在４００～１ ５００ ｂｐ之間，密集分布在７００～

１ ０００ ｂｐ之間，文庫插入片段平均大小約為８８０ ｂｐ。本研究所構建的水稻品種酵母雙雜交文庫經分析評價確定其質量達到了酵母雙雜交研究的標準，可以用來進行大規模的互作蛋白篩選實驗。

在植物與病原菌相互作用的研究中，人們通過酵母雙雜交系統，在不同的植物中篩選到了與抗病蛋白相互作用的蛋白分子。Ｍａｃｋｅｙ等［１２］通過篩選擬南芥的酵母雙雜交文庫，發現擬南芥的抗病蛋白ＲＰＭ１和ＲＰＳ２通過ＲＩＮ４蛋白與三種不同的病原菌Ａｖｒ蛋白相互作用，使擬南芥產生抗病反應。Ｙｕａｎ等［１３］在水稻中篩選出了與抗白葉枯基因Ｘａ１３互作的蛋白ＣＯＰＴ１和ＣＯＰＴ５，這兩個蛋白調節水稻體內銅離子的含量，從而使水稻產生抗病反應。但是，在水稻抗蟲研究中，由于并沒有克隆出水稻的抗蟲基因，所以很少有通過酵母雙雜交系統研究水稻與昆蟲相互作用的報道。目前，水稻抗褐飛虱基因Ｂｐｈ１４已經被成功克隆出來［５］，因此構建受褐飛虱取食的水稻酵母雙雜交文庫，能為篩選與Ｂｐｈ１４互作的蛋白分子，從而研究水稻抗褐飛虱的分子機理奠定基礎，并對研究植物與刺吸式口器昆蟲的相互作用具有參考意義。

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