Alu-LTR PCR方法檢測HAART治療系列各細胞亞群的整合型HIV-1 DNA

李 娟 焦艷梅 高艷青 寇卜心 張 彤 吳 昊

(首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院性病艾滋病臨床診療中心，北京 100069)

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是人體感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的一種嚴重危害人類健康的致死性傳染病。高效抗反轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)通過抑制病毒復制，恢復人體免疫功能。顯著地提高了艾滋病的治療效果，明顯延長了病人的生存時間，改善了病人的生活質(zhì)量，減少了病死率，因而逐漸發(fā)展成艾滋病的常規(guī)治療方法。人們最初希望在2～3年的HAART治療后能夠治愈HIV，但發(fā)現(xiàn)即使長時期用藥以后停止用藥，病人外周血仍可產(chǎn)生病毒，其主要原因在于病毒儲藏庫的存在［1-2］。Chun T W等［3］發(fā)現(xiàn)在靜止的CD4+T淋巴細胞中HIV-1病毒以整合的形式存在，形成了病毒儲藏庫。從急性期一直到疾病的晚期，HIV病毒顆粒主要由活化的CD4細胞產(chǎn)生。病毒優(yōu)先感染及殲滅HIV-1特異的CD4細胞。在急性期機體中大概存在一百萬到一億個感染的靜止CD4細胞。目前國內(nèi)外公認的是主要存在于長期存活的CD4細胞中。機體中病毒儲藏庫主要存在于長期存活的CD4細胞及濾泡樹突狀細胞(follicular dendritic cells，F(xiàn)DC)這 2 類細胞中［4］。而對于是否存在于CD8及B細胞內(nèi)仍存在著爭議。

Alu-PCR是目前常用的檢測整合型HIV-1 DNA的實驗方法。Alu序列是人類特有的，在基因組廣泛分布并高度保守的間隔重復序列，平均間隔4 000 bp［5-6］。根據(jù)Alu序列和HIV-1基因組中的相對保守序列分別設計引物，可得到整合型HIV-1基因［7-9］。本研究利用已經(jīng)建立的 Alu-LTR PCR方法，對HAART治療系列的CD4+T，CD8+T及B細胞進行檢測，明確不同細胞亞群及HAART治療的不同階段是否存在整合的HIV-1 DNA，對HIV病毒儲藏庫形成機制以及臨床選擇治療時機提供了理論和實踐依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

20例HIV-1陽性標本來自2009年3月至2010年8月期間在首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染科HIV隨訪患者，所有患者均經(jīng)過確證試驗為抗HIV-1陽性，選擇10例性別和年齡相匹配的健康未暴露于HIV-1者為陰性對照，研究對象情況見表1。

表1 研究對象情況Tab.1 General data of the subjects

1.2 方法

1)主要儀器和試劑:PCR擴增儀(Mastercycler Thermal Cyclers，美國)，瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-6C型，北京六一儀器廠)，數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng) (Gel Media System Tanon-1600R，上海天能科技有限公司)，CD4+T細胞、CD8+T細胞及B細胞純化試劑盒(德國Miltenyi公司)，DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，標準相對分子質(zhì)量DNA〔寶生物工程(大連)有限公司〕，PCR擴增試劑Taq酶(上海生物工程技術服務有限公司)。

2)純化CD4+T細胞:首先用淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，按照德國Miltenyi公司細胞分選試劑盒純化CD4+T，CD8+T及B細胞;用抗體進行細胞外染色，用流式細胞儀檢測其純度。

3)模板DNA的制備:用德國Qiagen公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取模板DNA，具體操作方法參照試劑盒說明書。

4)引物設計:首輪PCR Alu-LTR 5'端引物來自于人類保守的Alu序列，Alu-LTR 3'端引物來自于保守的HIV-1 LTR序列，為了增加檢測的特異性，在針對HIV-1LTR的引物前加了一段lamda T載體的一段，類似是一段通用引物，在人體及HIV里面都沒有。第2輪引物針對lamda T載體和U5區(qū)。首輪PCR產(chǎn)物稀釋后，利用針對HIV-1 LTR特異的引物進行第2輪套式PCR，首輪PCR擴增片段包括了HIV-1整合位點上游的人類基因組DNA和整合的HIV-1 LTR的序列，第2輪擴增R，U5區(qū)(圖1)。

圖1 Alu-LTR PCR方法檢測整合型HIV-1 DNA原理Fig.1 Principles of determination of integrated HIV-1 DNA with Alu-LTR PCR approach

5)PCR擴增:①PCR反應體系(50 μL):模板DNA 5.0 μL，dNTPs(Mg2+)4.0 μL，10 × PCR Buffer 5.0 μL，上游引物各 1.0、0.5、0.5 μL，下游引物各 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.4 μL，滅菌雙蒸水33.6 μL。以滅菌雙蒸水為空白對照，HIV-1陰性的健康人為陰性對照。②PCR反應適宜條件的選擇:第1輪的擴增條件:首先是94℃ 3 min;然后94℃ 30 s變性，66℃ 30 s退火，70℃ 5 min延伸，共22個循環(huán);最后72℃ 10 min。第2輪的擴增條件:首先94℃ 12 min;然后是95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共29個循環(huán);最后72℃ 10 min。③PCR產(chǎn)物的鑒定:每種PCR擴增產(chǎn)物各取5μL與1μL的1 0×上樣緩沖液混合，以及5 μL標準相對分子質(zhì)量DNA，分別加到含EB的1.0%瓊脂糖凝膠中。在90～110 V電壓下電泳25 min，巢式反應產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上形成可見的條帶。④PCR產(chǎn)物割膠純化、序列測定及序列比對:在凝膠成像系統(tǒng)下，將電泳后所在條帶的凝膠切下，用試劑盒純化并回收PCR產(chǎn)物，具體操作方法參照試劑盒說明書。委托北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司測序。

2 結果

純化后的CD4+T，CD8+T，B細胞用抗體進行細胞外染色，經(jīng)流式細胞儀分析后純化CD4+T，CD8+T，B細胞純度分別是97.94%、98.00%、92.45%，詳見圖2。

圖2 純化CD4+T，CD8+T，B細胞結果Fig.2 Results of CD4+T，CD8+T，B Cells purification

經(jīng)Alu-LTR PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳后，結果顯示20例患者HAART治療系列0、4、12 W的CD4+T細胞和CD8+T細胞均可擴增得到1條約240 bp的條帶，B細胞及陰性對照無擴增產(chǎn)物出現(xiàn)(圖3～5)。

圖3 CD4+T細胞Alu-LTR PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.3 Amplified products of HIV-1 by Alu-LTR PCR from CD4+T cell and agarose electrophoresis

圖4 CD8+T細胞Alu-LTR PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.4 Amplified products of HIV-1 by Alu-LTR PCR from CD8+T cell and agarose electrophoresis

圖5 B細胞Alu-LTR PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.5 Amplified products of HIV-1 by Alu-LTR PCR from B cell and agarose electrophoresis

3 討論

HAART是當前治療HIV慢性感染和AIDS最主要的臨床手段，可明顯改善HIV/AIDS患者的疾病進展和預后。雖然HAART可以使患者血漿中病毒降低到常規(guī)方法檢測不到的濃度，但患者體內(nèi)仍然存在低水平的病毒復制，此場所被稱之為HIV儲藏庫。這種儲藏庫在急性期感染后幾天內(nèi)產(chǎn)生［10］，另外在病毒活躍復制的過程中，儲藏庫不斷地產(chǎn)生。清除儲藏庫需要60年的時間［11］。儲藏庫的持久性使得人們要檢測其建立、保持和解決儲藏庫。

對于HIV儲藏庫的細胞場所，1997年Chun T W等［3］在HIV感染病人中證實，發(fā)現(xiàn)在靜止的CD4+T淋巴細胞中HIV-1病毒以整合的形式存在。目前研究［12］已經(jīng)證實HIV能感染CD8+T細胞，尤其感染晚期。這可能與CD8+T細胞激活CD4表達增加有關。

本研究首先通過Alu-LTR PCR方法檢測各細胞亞群是否存在整合型HIV-1 DNA，結果示外周CD4+T和CD8+T細胞內(nèi)均可檢測到整合型 HIV-1 DNA，CD8+T細胞所得目的條帶明顯弱于CD4+T細胞，說明HIV儲藏庫主要存在于CD4+T細胞內(nèi)。從急性期一直到疾病的晚期，HIV病毒顆粒主要由活化的CD4細胞產(chǎn)生。病毒優(yōu)先感染及殲滅HIV-1特異的CD4細胞。然而B細胞內(nèi)未得到陽性結果，因此不能說明B細胞內(nèi)存在整合型HIV-1DNA，進而不能說明B細胞是病毒儲藏庫存在的細胞。其次本研究對HAART治療系列0、4、12周各隨訪點標本進行擴增，所得目的條帶之間沒有明顯差異，說明隨著HAART治療的進程，整合型HIV-1 DNA仍然存在。

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