皖北地區(qū)雞致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏實驗

信陽農(nóng)業(yè)高等專科學校 吳海港

信陽職業(yè)技術學院 張文建

華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 王春梅

雞大腸桿菌病是由致病性血清型的大腸桿菌引起的多種疾病的總稱。在臨床上可表現(xiàn)為臍炎、敗血癥、肉芽腫、全眼球炎、氣囊病、腹膜炎、輸卵管炎等（劉振湘和姚衛(wèi)東，2008）；還常常與病毒和其他細菌性疾病并發(fā)，造成雞群的高死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失，為了解皖北地區(qū)雞肺臟中大腸桿菌的血清型及藥敏性，以便有效地開展預防和治療工作，本試驗進行了雞肺臟大腸桿菌的分離、血清型鑒定及藥敏實驗。

1 材料與方法

1.1 材料 病料于2009年1～9月，從皖北地區(qū)界首、太和、臨泉、亳州等10個縣的42家肉種雞、肉仔雞、蛋種雞、蛋雞場采取；大腸桿菌標準血清由中國獸藥監(jiān)察所提供；試驗用小白鼠由華中科技大學同濟醫(yī)學院提供，體重15～25 g；雛雞購于湖北農(nóng)科院SPF雞場；標準菌株購于中國獸藥監(jiān)察所；藥敏試紙購于杭州藥物研究所。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離鑒定 無菌采取具有敗血癥、心包炎、肝周炎等病理變化的病死雞心血、肝臟、脾臟，分別接種于普通肉湯、普通瓊脂、血液瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，挑選麥康凱瓊脂平板上磚紅色菌落接種普通瓊脂斜面進行純培養(yǎng)，培養(yǎng)后膠塞密封，置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫瑫r另挑選單個菌落涂片革蘭氏染色，進行菌體形態(tài)和染色特征的觀察。

1.2.2 生化鑒定 取M.C瓊脂平板上粉紅色單菌落接種于普通肉湯，于37℃培養(yǎng)18 h，按常規(guī)方法進行糖類發(fā)酵試驗及生化反應（陸承平，2007）。

1.2.3 致死性試驗 選取體重15～25 g健康小白鼠和10日齡雛雞各105只，分別隨機分組，每組3只，試驗組小白鼠腹腔接種24 h肉湯培養(yǎng)物0.2 mL/只，試驗組雛雞肌肉注射24 h肉湯培養(yǎng)物0.4 mL/只，對照組分別用同樣方法接種滅菌生理鹽水。觀察發(fā)病和死亡情況、剖檢變化，并進行細菌分離。

1.2.4 血清型鑒定 經(jīng)分離培養(yǎng)、形態(tài)特點和生化試驗鑒定為大腸桿菌后，再用普通瓊脂進行純培養(yǎng)（37℃、18 h），然后用少量5 mL/L石炭酸生理鹽水將菌苔洗下，制成濃稠菌懸液，經(jīng)過121℃高壓2 h，破壞其K抗原，冷卻后取一鉑金耳與血清（5～10倍稀釋）在玻板上混勻，如0.5 min內出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應，同時以菌懸液與生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象（夏業(yè)才和潘松年，1991）。

1.2.5 藥敏實驗 按藥敏紙片說明書進行操作。

2 結果

2.1 細菌分離 在普通瓊脂平皿板上長出表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形微凸起，中等大的菌落，在血液瓊脂平板上長出菌落較大，邊緣整齊，并有隆起的灰白色菌落，多數(shù)不溶血。在麥康凱瓊脂平板上，形成中等大小的磚紅色菌落，在伊紅美藍瓊脂平板上，形成帶有金屬光澤的紫黑色小菌落。在肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后，呈均勻混濁，管底有淡白色黏稠沉淀，管壁液面有菌環(huán)。

2.2 染色鏡檢 病料及培養(yǎng)物涂片染色鏡檢均可見兩端鈍圓，多數(shù)散在排列，革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 生化鑒定結果 34株致病性大腸桿菌的生化試驗結果見表1。從表1可以看出各株均能在三糖鐵培養(yǎng)基上產(chǎn)酸產(chǎn)氣使培養(yǎng)基變黃，均不產(chǎn)生H2S。在發(fā)酵葡萄糖、V-P試驗、M-R試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽利用試驗等常規(guī)生化試驗結果完全符合大腸桿菌的生化特征，但在某些糖、醇的常規(guī)生化試驗結果出現(xiàn)了一些差異。

表1 各菌株的生化鑒定結果

2.4 致死試驗結果 試驗動物接種后連續(xù)觀察8 d，小白鼠試驗結果為25株能全部致死小白鼠，4株部分致死，5株不能致死小白鼠。剖檢死亡鼠，心外膜出血，肝腫脹，發(fā)黑或出血。雛雞試驗結果為23株能全部致死雛雞，5株部分致死，6株不能致死雛雞，剖檢死亡雛雞，表現(xiàn)為纖維素性心包炎、心包積液，肝周炎、肝表面被一層薄膜狀纖維素性滲出物覆蓋，氣囊炎。從死亡小白鼠和雛雞肝臟、腹水、脾臟回收菌的形態(tài)染色，生化特性與接種菌一致。

2.5 血清型鑒定結果 從10個縣市共分離34株大腸桿菌，除2株未能定性外，共出現(xiàn)10種血清型，結果見表2。從表2可以看出，從雞肺臟中分離的大腸桿菌以 O2、O78、O26、O22、O1為主， 這 5種血清型合計菌株26株，占定性菌株的80.4%。

表2 32株致病性大腸桿菌的血清型

2.6 藥敏實驗 結果見表3，分離的大腸桿菌對強力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、培氟沙星高度敏感，對氧氟沙星、恩諾沙星、新霉素、氨芐青霉素中度敏感，對環(huán)丙沙星、利福平、氟哌酸、鏈霉素、紅霉素、土霉素不敏感。

表3 34株大腸桿菌對14種抗生素的藥敏實驗結果

3 討論

3.1 血清型鑒定 結果表明，34株雞致病性大腸桿菌的血清型比較復雜，不同來源的大腸桿菌血清型差異較大，同一來源的菌株O血清型也多不相同。對皖北地區(qū)10個縣市42個雞場中病雞肺臟中分離的大腸桿菌血清型以 O2、O78、O26、O22、O1為主。

3.2 大腸桿菌藥敏試驗 此次分離的大腸桿菌對強力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、培氟沙星高度敏感，而對環(huán)丙沙星、利福平、氟哌酸、鏈霉素、紅霉素、土霉素不敏感。研究表明，大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥性為56.25%，對卡那霉素、新霉素和慶大霉素較敏感（Zhou等，2009；劉吉山等，2000）。鄒玲等（2007）報道，大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥性達81.8%，而本試驗分離的大腸桿菌對環(huán)丙沙星、利福平、氟哌酸的耐藥性較高，可以看出近幾年大腸桿菌對氟喹諾酮的耐藥性有增高趨勢。這種耐藥性的出現(xiàn)可能與菌株長期處于環(huán)境中抗生素的選擇性壓力及耐藥基因通過染色體或耐藥質粒在菌群間的廣泛傳播或擴散有關（Prats等，2000）。最近幾年家禽養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，由于缺乏養(yǎng)殖業(yè)方面的知識，在飼料添加劑及治療中常盲目使用抗菌藥物，導致許多耐藥性菌株產(chǎn)生。大腸桿菌的血清型繁多也是產(chǎn)生耐藥性的原因之一（許蘭菊等，2004），在選擇抗菌藥物上建議考慮采取聯(lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方式，一方面可以充分發(fā)揮抗菌藥物之間的協(xié)同作用，增加療效；另一方面可以避免細菌長期與某一種藥物接觸，減少產(chǎn)生耐藥性幾率。由于大腸桿菌的血清型分布地區(qū)差異比較大，臨床用藥的差異等因素，使得各地區(qū)、各養(yǎng)殖場大腸桿菌的耐藥譜差異很大（刁有祥等，2002）。因此，定期對分離菌株進行抗生素敏感性的監(jiān)測，對有效防治養(yǎng)雞場細菌性疾病有著重要的意義。

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