好氧反硝化菌Pseudomonas aeruginosa NO62篩選分離與性質鑒定

蔡亞君,桂 震,李 鋒,楊小俊 (武漢紡織大學環境科學研究所,湖北武漢430073)

反硝化菌在自然界氮素循環以及水環境氮的污染治理中起著重要的作用,目前水處理生物處理工藝中的反硝化菌基本為厭氧反硝化菌,而厭氧反硝化菌因為其生長條件嚴格,限制了生物除氮工藝的發展[1]。因此,對供氧條件不敏感的好氧或兼性厭氧反硝化菌株的篩選及對其反硝化性質的研究,在水處理中的應用研究具有更廣泛的實際應用價值。

本研究從生活污水處理場的活性污泥中篩選分離出具有好氧反硝化活性的菌株NO62,對其進行生理生化特性以及16S rDNA的分子生物學鑒定,在鑒定結果的基礎上,對菌株的好氧反硝化活性進行檢測的同時,也進行了反硝化功能蛋白——硝酸鹽還原酶的編碼基因的初步研究,取得了較好結果。對該菌株生理生化特性、反硝化特性、功能基因等的研究,可為該菌株在污水脫氮處理中的應用奠定良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

樣品來源:取自武漢紡織大學生活污水處理場活性污泥。

硝酸鹽培養基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,硝酸鈉1 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0～7.2。固體培養基按2%比例添加瓊脂。

主要儀器與設備:搖床、恒溫培養箱、Vitek-32全自動細菌鑒定系統、iCvcler Thermal Cycler梯度PCR儀、JY3000+凝膠電泳儀、Syngone Cs-Bos H R凝膠成像系統等。

1.2 好氧反硝化菌的鑒定

將目的菌株平板劃線活化24 h后,觀察單菌落形態,鏡檢后進行革蘭氏染色、接觸酶試驗。挑取單菌落用全自動細菌鑒定系統Vitek-32進行生化鑒定。同時,采用16S rDNA PCR方法進行分子生物學鑒定,測序由上海生工生物工程技術有限公司完成。

1.3 好氧反硝化活性測定

將篩選到的活性較高的反硝化菌轉接到液體培養基中活化12 h,再以1∶100比例轉接到50 mL硝酸鹽培養基中25℃、200 r/min培養,定時取樣測定菌體生長狀態 (分光光度法測600 nm波長下光密度D600)及培養基中亞硝態氮含量以檢測其反硝化活性。-N含量檢測采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法[2]。

1.4 反硝化菌NO62總DNA的提取

NO62接種到有5 mL液體培養基的試管中,振蕩培養 (37℃,150 r/min)過夜。取1 mL菌液于1.5 mL離心管中,1 000 r/min離心1 min收集菌體,棄去上清液。加入0.5～0.7 mL含10 mg/mL溶菌酶的TES(30 mmol/L Tris,5 mmol/L EDTA,20%蔗糖,pH 8.0),振蕩混勻后于37℃下水浴30～50 min。加入0.1 mL蛋白酶PK,0.1 mL10%SDS,溫和混勻后于 37℃下水浴30～50 min。12 000 r/min離心15 min,取上清。體積酚∶氯仿∶異戊醇 (25∶24∶1)抽提2次,取上清,加入2.5倍體積的冰凍無水乙醇或等體積冰凍異丙醇于—20℃下放置30 min以上,于12 000 r/min下離心30 min,棄去上清液,用70%乙醇洗滌,干燥,加20 μ L T E,待DNA充分溶解后保存于—20℃。

瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA,凝膠成像系統分析DNA大小及量。

1.5 硝酸鹽還原酶編碼基因檢測

根據GenBank中假單胞菌將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的硝酸鹽還原酶編碼基因narG序列的保守區設計了引物narGF:5'-TATGTCGGCCAGGAGAA-3'和narGR:5'-TTCTCGTACCAGGTAGC-3'。引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。反應體系:10×TaqDNA聚合酶緩沖液2.5 μ L,引物narGF/narGR各100 pmol,dNTPs 40 μ mol,0.1 μ L總DNA,TaqDNA聚合酶 1 U,加入無菌的去離子水至總體積為25 μ L。PCR反應程序:94℃預變性5 min,94℃1 min、50℃1 min、72℃1 min循環35次,最后72℃延伸7 min。反應結束后取PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳分析。

2 結果與分析

2.1 反硝化菌NO62鑒定結果

對反硝化菌NO62的形態特征進行了鑒定,菌落為藍綠色、半透明,圓形、凸起、邊緣規則,鏡檢 (1 500×)為革蘭氏染色陰性細長桿狀菌 (圖1)。

對NO62初步鑒定后,利用Vitek-32細菌鑒定系統對其生理生化特征進行進一步鑒定 (表1),鑒定NO62為銅綠假單胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)。

圖1 菌株NO62菌體形態圖

用瓊脂糖凝膠電泳檢測16S rDNA基因PCR產物為大小約1 500 bp的片段。用PCR產物純化試劑盒對PCR產物純化后測序,對測序得到菌株NO62的全長1 436 bp 16S rDNA序列進行Blast分析,結果表明,NO62菌株的16S rDNA與銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)菌株LESB58、PA7、UCBPP-PA14PAO1的16S rDNA相似性均達100%;與施氏假單胞菌 (Pseudomonas stutzeri)A1501相似性達97%;與門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)ymp相似性達96%;與惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)KT2440相似性達95%;與假單胞菌蟲 (Pseudomonasentomophila)L48相似性達95%;與熒光假單胞菌 (Pseudomonas f luorescens)Pf0-1相似性達95%;與棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii)DJ相似性達96%。

表1 菌株NO62生理生化特征鑒定結果

2.2 好氧反硝化活性分析結果

將活化培養12 h后菌液按1∶100比例轉接到新鮮液體培養基中,分別在不同溫度下 (25、30、37、40、42℃)好氧培養 (150 r/min),從初始轉接開始取樣,檢測其菌體量 (D600表示,圖2)及亞硝態氮濃度 (圖3)。

圖2 菌株NO62好氧培養時生長曲線

圖3 菌株NO62好氧培養時反硝化活性

由圖2可知,NO62在37℃培養時生長狀況最好,培養至12 h時菌體量最大,D600達到1.012。在25℃和30℃培養時,生長狀況相對較差,培養至12 h時菌體量最大,最高D600值分別為0.703和0.863。而在40℃及42℃培養時基本不生長,最高D600僅為0.347(12 h)和0.207(10 h)。

由圖3可知,NO62培養8 h后開始表現反硝化活性,隨著培養時間的增加、菌體量的增大,硝態氮不斷轉化為亞硝態氮,培養至10 h時,培養物中亞硝態氮的積累量達到最高,在30℃培養時,反硝化活性最好,最高亞硝態氮濃度為1.154 mg/L(10 h),在25℃和37℃培養時,反硝化活性相對較低,最高亞硝態氮濃度分別為0.898 mg/L(10 h)和0.787 mg/L(10 h)。此后隨著培養的繼續,亞硝態氮濃度逐步降低。

綜合菌體生長及反硝化活性兩個方面的結果,在30℃培養時,NO62的生長狀況和反硝化活性都相對較高,因此,后續實驗選取30℃作為NO62的培養溫度對其進行研究。

2.3 硝酸鹽還原酶編碼基因檢測結果

對菌株NO62硝酸鹽還原酶編碼基因narG的PCR檢測結果 (圖4)顯示為陽性,其擴增出的特異片斷大小約為694 bp。

3 討 論

從活性污泥中分離得到1株具有較高好氧反硝化活性的菌株NO62,結合細菌鑒定以及16S rDNA鑒定系統鑒定,確定該菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),將其命名為 P.aeruginosa NO62。NO62在37℃培養時的生長狀況最好,能夠最快進入對數生長期,且生長最旺盛,25℃和30℃培養時的生長狀況稍差,但與37℃培養時相差不大,而培養溫度高于40℃后基本不生長。30℃培養時,NO62的反硝化活性最高,亞硝態氮的積累量最大,而25℃和37℃培養時,NO62的反硝化活性稍低。菌株NO62的反硝化活性與生長曲線一致,在菌株對數生長期表現反硝化活性,且在菌量最大時亞硝酸鹽積累同時達到最高。隨著培養時間的增加,亞硝態氮的濃度逐漸降低,推測亞硝態氮可能被進一步還原成了NO、N2O或N2,需要進一步的實驗證明其最終的還原產物。

圖4 菌株NO62 narG基因PCR檢測結果

本研究僅對菌株NO62的好氧反硝化活性及相關功能酶進行了初步鑒定,而本研究所使用的培養條件還有待優化,對該菌株的好氧反硝化的機理及其功能酶也有待進一步研究。此外,現在逐漸發展起來的一種新型高效生物除氮工藝——短程硝化反硝化工藝,將氮的去除通過簡單的途徑即能實現,比傳統硝化反硝化生物脫氮節省了25%的耗氧量、40%的碳源,且大大縮短了反應歷程,提高了脫氮效率[3～5]。短程消化反硝化工藝在微生物水平上主要由氨氧化菌將氨鹽氧化成亞硝酸鹽后由反硝化菌將亞硝酸鹽直接還原成N2。而NO62菌株已證明能將亞硝酸鹽反硝化,因此,它在短程硝化反硝化工藝中也具有良好的應用前景。

[1]鄭 平,徐向陽,胡寶蘭,等.新型生物脫氮理論與技術[M].北京:科學出版社,2004.55～74.

[2]中國標準出版社第二編輯室.水質分析方法國家標注匯編[M].北京:國家標準出版社,1996.149～152.

[3]肖文勝,郭建林.短程硝化反硝化生物脫氮工藝及影響因子[J].黃石理工學院學報,2005,(2):21～23.

[4]袁林江,彭黨聰,王志盈.短程硝化-反硝化生物脫氮[J].中國給水排水,2000,16(2):29.

[5]李松良,林華東,王 鵬.生物脫氮的短程硝化反硝化及影響因素[J].能源環境保護,2007,21(4):16～19.