基質金屬蛋白酶 MM P-9與其抑制劑 TIMP-1在子宮內膜腺癌中的表達及其臨床意義

盧北燕,王艷平

(佳木斯大學附屬第一醫院婦產科,黑龍江 佳木斯 154003)

子宮內膜癌是女性生殖道常見的三大惡性腫瘤之一,約占女性總癌瘤的 7%,占女性生殖道惡性腫瘤的 20%～30%[1],近年來發病率有升高并且發病年齡有年輕化的趨勢,更是西方國家女性最常見的女性生殖道惡性腫瘤,嚴重威脅人類健康[2]。本試驗是通過子宮內膜癌組織的免疫組化的研究 ,了解子宮內膜癌患者組織中 MM P-9、TIM P-1的表達,并采用多參數統計學分析該檢測結果,探討 MM P-9、TIMP-1在腫瘤轉移、侵襲中的作用,為子宮內膜癌的臨床監測及預后判斷提供新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

收集佳木斯大學附屬第一醫院婦產科 2006—01～2009— 12住院手術并經病理確診的 60例子宮內膜樣腺癌患者所存檔的組織蠟塊,所有患者術前均未作過任何化療、放療或性激素類藥物等治療,其中所有標本的臨床和病理資料完整,病理診斷均經其中所有標本的臨床和病理資料完整,病理診斷均經病理科專家復核。患者年齡 31～ 73歲,平均 52歲,≤50歲者 32例,＞ 50歲者 28例;35例已絕經,25例未絕經;子宮內膜樣腺癌按照 2000年國際婦產科聯盟(FIGO)手術 -病理分期標準:Ⅰ 期 33例,Ⅱ期 23例,Ⅲ期 4例;組織學分級:高分化(Gl)17例,中分化(G2)20例,低分化(G3)23例;子宮肌壁侵潤深度:無肌層浸潤 6例 ,侵及子宮壁淺肌層 (≤1/2肌層 )者 31例 ,侵及深肌層 (＞ 1/2肌層)者 23例;淋巴結轉移(行淋巴結清掃和取樣者):已發生淋巴結轉移者6例,無淋巴結轉移者 28例。另取同期正常子宮內膜組織(取自子宮肌瘤行手術切除術的患者)18例、非典型增生性子宮內膜組織存檔蠟塊 23例作為對照。所有標本均經 10%福爾馬林液固定,石蠟包埋,5μm厚連續組織切片。

1.2 方法及步驟

①脫蠟和水化:將組織切片經 58℃烤片 1h,按以下次序脫蠟:二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各浸 10min;無水乙醇 10min;90%乙醇 10min;80%乙醇 10min;雙蒸水沖洗 3次;PBS浸洗 3min共 3次。②3%過氧化氫處理:浸于新鮮培植的 3%過氧化氫溶液中避光放置 10min,以滅活內源性過氧化物酶。雙蒸水沖洗 3次,PBS浸洗 3min,共 3次。③抗原修復:孵育盒中放人切片,并加入 50mL 0.01mol/L枸櫞酸緩沖液 (pH=6.0),于微波爐加熱中火 MV(95℃)5min共兩次,兩次之間加入10mL枸櫞酸緩沖液,第二次加熱以后從微波爐中取出孵育盒,自然冷卻至室溫(18～ 25℃),PBS浸洗 3min共 3次。 ④封閉:滴加 10%正常山羊血清封閉 30min,消除非特異性反應,甩去多余液體,不洗。⑤滴加一抗:分別滴加一滴 Bcl-xl鼠抗人單克隆抗體和兔抗人 Beclin1多克隆抗體,濕盒中孵育,4℃過夜 ,PBS浸洗 3min共 3次,小心擦拭多余液體。⑥滴加二抗:分別滴加一滴生物生化山羊抗兔 IgG,濕盒中孵育,37℃溫箱放置 50min,PBS浸洗 3min共 3次,小心擦拭多余液體。⑦滴加三抗:分別滴加一滴高敏過氧化物酶復合物,濕盒中孵育,37℃溫箱放置 50min,PBS浸洗 3min共三次,小心擦拭多余液體。⑧DAB-H2O2顯色:每張切片上滴加 1～ 2(30～ 40μL)滴顯色液于標本上,置濕盒內室溫顯色,一般顯色 5～ 15min。若無背景出現可繼續顯色 ,充分水洗。⑨復染:Harris蘇木素復染,充分水洗。L脫水、透明、封片:50%、75%、85%、95%和 100%系列乙醇脫水;二甲苯透明;重型光學樹脂封片。光學顯微鏡下觀察結果。對照實驗:以 PBS替代一抗作為陰性對照,以試劑盒內已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 結果判定

光學顯微鏡下均以胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色細胞,MM P-9與 TIM P-1的陽性顆粒均分布于細胞漿。判斷標準:參考師建國[1,2]的評估標準:每例切片選取內膜細胞密集的區域,連續觀察高倍視野,對腫瘤細胞進行細胞計數,每個視野計數 50個細胞,共 1000個細胞,通過計算著色細胞所占比例及評定著色強度而分級。①無著色細胞、背景同陰性對照或者陽性細胞比例不超過 5%者為陰性(-);②陽性細胞呈淡棕黃色和/或陽性細胞率 ＜50%者為弱陽性(+);③陽性細胞呈深棕黃色和 /或陽性細胞率≥50%者為強陽性(++)。陽性細胞的判斷標準:免疫組化的陽性表達均為各自染色條件下結構完整、定位明確、染色對比清晰的棕黃色細胞。為便于統計,將 (+)和(++)統歸為陽性。

1.4 統計分析

采用秩和檢驗,確切概率法及 Spearman等級相關分析,數據采用 SPSS 16.0軟件包分析。顯著性檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 MM P-9蛋白在不同子宮內膜組織中的表達

MM P-9蛋白的表達主要定位于子宮內膜腺上皮細胞的胞漿,呈棕黃色顆粒,彌漫性或局灶性分布。見表 1。

表 1 MM P-9在不同子宮內膜組織中的表達

2.2 M MP-9蛋白與子宮內膜樣腺癌臨床病理特征的關系

見表 2。

表 2 TIM P-1蛋白的表達與子宮內膜樣腺癌臨床病理特征的關系

3 討論

本研究采用免疫組化的方法,通過檢測正常子宮內膜、不典型增生子宮內膜和子宮內膜腺癌組織中 MM P-9蛋白的表達得出初步結論:MMP-9蛋白在正常內膜組織、不典型增生內膜組織及子宮內膜樣腺癌中的陽性表達率分別是16.67%、56.52%和 78.33%,三者之間的陽性表達率有統計學差異。在子宮內膜由良性到惡性轉變的不同階段,M MP-9陽性表達呈現逐漸增強的趨勢,說明其與子宮內膜組織癌變關系密切,與子宮內膜癌的發展演進有關,此結論與大多數研究的結論基本一致。結合患者的臨床病理特征進行了分析,發現 33例Ⅰ期子宮內膜癌中,MM P-9蛋白陽性表達21例,23例Ⅱ期子宮內膜癌中,MM P-9蛋白陽性表達 22例,4例Ⅲ A期患者 MMP-9的陽性表達為 4例,三者 M MP-9蛋白陽性表達率比較有統計學差異,晚期子宮內膜癌中MM P-9蛋白的表達明顯高于早期。MM P-9通過降解細胞外基質,為腫瘤細胞向周圍組織浸潤提供了有利條件,同時還為腫瘤新生血管的生長提供了空間。Iurlaro等[3]用免疫組化、原雜交位技術檢測了 64例子宮內膜癌及 15例正常對照組的 MM P-9的表達情況,子宮內膜癌組織中 MM P-9的表達顯著高于正常對照組 (P＜0.01),并隨病理組織分級(Gl,G2,G3)和肌層浸潤程度的增加而表達增加,本實驗結果與此相一致。近年來國內外許多學者研究證明,MM Ps與 TIM Ps之間的相互作用在月經發生、子宮內膜的重塑、胚胎著床及胚胎種植等生理過程中起著關鍵的作用[4]。

本研究采用免疫組化的方法,通過檢測正常子宮內膜、不典型增生子宮內膜和子宮內膜腺癌組織中 TIM P-1蛋白的表達得出初步結論:TIM P-1蛋白在正常內膜組織、不典型增生內膜組織及子宮內膜樣腺癌中的陽性表達率分別是72.22%、65.22%和 41.67%,三者之間的陽性表達率有統計學差異。在子宮內膜由良性到惡性轉變的不同階段,TIMP-1陽性表達呈現逐漸增強的趨勢,說明其與子宮內膜組織癌變關系密切,與子宮內膜癌的發展演進有關,此結論與大多數研究的結論基本一致[3]。

本研究還結合患者的臨床病理特征進行了分析,發現:(1)33例Ⅰ期子宮內膜癌中,TIM P-1蛋白陽性表達 18例,23例Ⅱ期子宮內膜癌中,TIM P-1蛋白陽性表達 5例,4例Ⅲ A期患者 TIM P-1的陽性表達為 0例,三者 TIMP-1蛋白陽性表達率比較有統計學差異,早期子宮內膜癌中 TIMP-1蛋白的表達明顯高于晚期。 TIM P-1可與 MM P-9前體及有活性的 MM P-9形成高度親和的、非共價鍵結合的復合物。重要的是 TIM P-1與活化的或非活化的 92kDa的MM P-9的結合抑制了 MM P-9水解蛋白的活性 ,TIMP-1還被認為作為一種轉錄抑制劑抑制 M MPs基因的轉錄[91];(2)G1組中的 TIM P-1蛋白陽性表達率高于 G3,TIM P-1蛋白的表達隨著病理分級的增加呈減少趨勢,病理分級是反映腫瘤生物行為的最本質特征之一,分化越差,其生物學行為越惡劣,預后越差;(3)無肌層浸潤的陽性表達明顯高于有肌層浸潤的患者;浸潤深度≤1/2組及浸潤深度＞1/2組的表達有顯著性差異并且隨肌層浸潤程度的加深其表達呈減少趨勢;(4)TIMP-1蛋白在有淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組的陽性表達率差別不大,無統計學意義,與多數研究不一致,可能與淋巴結轉移的病例太少有關。在 60例子宮內膜樣腺癌患者標本中,MM P-9的陽性表達為 47例,而 TIMP-1的陽性表達為 23例。兩者表達呈負相關性(r=-0.603,P= 0.0004)。腫瘤細胞及間質細胞合成的MM P-9,正好可以降解基底膜主要成分Ⅳ型膠原,從而促進腫瘤的侵襲和轉移[6]。 TIM P-1是 MM P-9特異性抑制劑,TIM P-1可與 MM P-9前體及有活性的 MM P-9形成高度親和的、非共價鍵結合的復合物。可認為兩者在腫瘤的發生、浸潤和轉移過程中相互抑制、共同作用。由于手術-病理分期、組織分級、肌層浸潤和淋巴結轉移可反映疾病惡性程度 ,與患者預后相關,對 MM P-9、TIM P-1的測定可幫助臨床醫師判斷預后,指導臨床治療,因此于 MM P-9陽性而 TIM P-1陰性表達的患者制訂合理的綜合治療方案。

[1]樂杰.婦產科學 [M].第 7版,北京:人民衛生出版社,2008,272

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