紅景天苷與腦源性神經營養因子聯合對 NSCs定向分化及對癲癇影響

和 梅,張 瑤,關雪蓮,侯立醇,張淑萍,張軍武,劉力學,劉美玲

(1.佳木斯大學附屬第一醫院神經內科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學研究生學院,黑龍江 佳木斯 154007)

癲癇是神經系統中僅次于腦血管病的第二大疾病,我國約 600多萬患者,其中 25%為難治性癲癇 ,目前主要有藥物和外科治療兩種手段,其效果均不理想。現今神經干細胞移植治療癲癇已是研究熱點。本實驗通過觀察紅景天苷、腦源性神經營養因子(BDNF)聯合對體外海馬神經干細胞(NSCs)向 r-氨基丁酸(GABA)能神經元定向分化的影響及移植對致癇鼠的作用,為神經干細胞進一步研究及臨床應用抗癲癇治療方法提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

新生 24h內 Wistar乳鼠 2只(佳木斯大學實驗動物中心提供),以培養傳 3代的神經干細胞為材料設含 10%胎牛血清培養液為對照組、10%胎牛血清培養液分別加 BDNF、紅景天苷、BDN F和紅景天苷為實驗組,培養 3d、7d、14d。紅景天苷最終濃度 10 μg/mL通過預實驗得。健康的雄性 Wistar大鼠,體重為(220±20)kg;鼠齡 3～ 4個月(佳木斯大學動物中心提供),給以戊四氮腹腔注射,制作大鼠癲癇模型,隨機選取造模成功的大鼠 72只分 3組:模型組;移植神經干細胞組;移植神經干細胞+BDNF+紅景天苷組。每組分為 7d、14d、21d、28d四個時間點進行觀察,每個時間點為 6只大鼠。

1.2 試劑與儀器

紅景天苷(編號:110818,中國藥品生物制品檢定所);BDNF、兔抗鼠 Nestin一抗,兔抗鼠 NSE一抗(北京搏奧森生物技術有限公司);Brdu試劑、驢抗鼠 Brdu一抗、兔抗鼠GAD65一抗(武漢搏士德生物工程有限公司);EGF、bFGF(U? S? A)等;胎牛血清 (國產);倒置熒光顯微鏡(重慶蔡康公司),TC2323型二氧化碳培養箱(美國 Sheldon公司 ),單臂腦立體定向儀(M P8000)深圳市瑞沃德公司,微量進樣器(10ul)上海激光醫學儀器廠等。

1.3 神經干細胞的培養及鑒定

利用無血清培養技術,在體外進行培養及傳代后,進行神經干細胞 Nestin免疫熒光鑒定 Nestin鑒定成功后,將傳 3代的神經干細胞接種于六孔培養板中,分 4組,每組 6孔。各組細胞分別用含血清、BDN F、紅景天苷、BDNF和紅景天苷培養液培養,各自培養 3d、7d、 14d,然后進行 Brdu、NSE、GAD65免疫熒光鑒定(Brdu用 FITC免疫熒光法顯色為綠色,N SE、GAD65用 Cy3免疫熒光法顯色為紅色),方法同Nestin鑒定。

1.4 分化率的計算

同一視野下分別對 Brdu/NSE、Brdu/GAD65陽性細胞和明視野下的總細胞計數、分化率為 Brdu/N SE、Brdu/GAD65陽性細胞數 /明視野下的總細胞數,同一張片子選取四個不同視野,取平均值。

1.5 癲癇大鼠模型成功的判定

發作分級參照 Racine分級標準[1]達標準后均停止給藥。Racine分級標準為:0級無驚厥,1級面部痙攣,二級面部痙攣+節律性點頭,3級面部痙攣節律性點頭前肢陣攣,4級面部痙攣+節律性點頭前肢陣攣后肢站立,5級面部痙攣節律性點頭前肢陣攣后肢站立跌倒,達到三級為入選標準。

1.6 神經干細胞移植

移植時間為大鼠癲癇模型制作后 4～ 5d,方法為用微量注射器行大鼠左側大腦海馬 CA3區注射移植,參照包新民[2]著《大鼠腦立體定位圖譜》,將微量注射器針頭定位于靶點上方,緩慢進針,到靶點后,每次計量為 5μL,注入時應緩慢注入(＞ 5min),含細胞量為 5×106個 /μL,模型組不予移植。術后實驗動物在動物房內正常飼養,所有大鼠在神經干細胞移植手術后均不用免疫抑制劑。

1.7 移植前后癲癇大鼠的行為學觀察

所有癲癇大鼠在制作模型后 ,先采用 Racine分級標準法進行癲癇的發作次數和級別的觀察。在大鼠進行神經干細胞移植治療后,(即移植后 1w、2w、3w、4w)兩次采用 Racine分級標準法對大鼠進行癲癇發作的觀察,具體方法同上。

1.8 統計學分析

計數資料用i2檢驗,計量資料(±s)多組間比較用方差分析,兩兩比較用q檢驗,所有數據用 spss11.0統計分析軟件處理及 Excel2003軟件處理,P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Brdu/NSE陽性分化率比較

組內比較:BDN F組、紅景天苷組 Brdu/NSE陽性分化率 7d與 3,14d相比差異有統計學意義 (P＜0.05),BDNF和紅景天苷組 Brdu/NSE陽性細胞分化率 7、14d與 3d相比差異有統計學意義 (P＜0.05)。但 7d和 14d比無統計學意義;組間比較:紅景天苷組、BDNF和紅景天苷組在 7、14d與對照組、BDN F組比差異有統計學意義 (P＜0.05),其中BDNF和紅景天苷組 14d的分化率明顯高于紅景天苷組,具有統計學意義 (P＜ 0.05)。見表 1。

2.2 Brdu/GAD65陽性分化率

組內比較:BDNF組 7d與 3d比較差異有統計學比較(P＜0.05),BDN F和紅景天苷組 7、14d與 3d相比差異有統計學意義 (P＜0.05),而 14d與 7d比差異有統計學意義(P＜0.05);組間比較:7dBDNF組、BDN F和紅景天苷組與其他兩組相應時間點比較差異有統計學意義 (P＜0.05),而前兩者之間比較無統計學意義,BDNF和紅景天苷組 14d與其他三組相對應時間點比較差異有統計學意義(P＜ 0.05)。見表 2。

2.3 移植后大鼠癲癇發作次數比較

N SCs+BDNF+紅景天苷組分化率最高為篩選組,給予進行癲癇大鼠移植。癲癇發作次數的比較見表 3,發作次數以一周內單位動物癲癇發作次數的均數計算,前兩周各組癲癇大鼠發作次數都有所減少,但差異無統計意義。在第三周時,NSCs+BDN F+紅景天苷組移植組大鼠癲癇發作次數較模型組和 NSCs移植組明顯減少,差異有統計學意義(P＜0.05),在第四周,NSCs+BDNF+紅景天苷移植組大鼠癲癇發作次數較其他的組明顯減少,有統計學意義(P＜0.05),說明 N SCs+BDNF+紅景天苷共移植后能降低大鼠癲癇發作次數。

表 1 各組不同時間點的 Brdu/NSE陽性分化率(%,±s,n=6)

表 1 各組不同時間點的 Brdu/NSE陽性分化率(%,±s,n=6)

注:#組內比較 P ＜0.05。△:組間比較 P ＜ 0.05。△△:與紅景天苷組 14d時比較 P ＜ 0.05。

時間(d) 對照組 BDNF組 紅景天苷組 BDNF和紅景天苷組3 11.506± 0.35 11.502± 0.60 11.160± 0.462 11.128± 0.501 7 12.386± 1.795 12.577± 0.851# 14.796± 1.466# △ 15.586± 1.410# △14 12.169± 0.715 12.276± 0.960 13.627± 1.186△ 15.912± 1.546# △△

表 2 各組不同時間點的 Brdu/GAD65陽性分化率(%,±s,n=6)

表 2 各組不同時間點的 Brdu/GAD65陽性分化率(%,±s,n=6)

注:#組內比較 P ＜ 0.05。## :與 BDN F組 3d時比較 P ＜ 0.05。##:與 BDN F和紅景天苷組 7d時比較 P ＜ 0.05。△ :組間 P ＜ 0.05。

對照組 BDNF組 紅景天苷組 BDNF和紅景天苷組時間(d)10.119± 0.812 10.621± 0.300 10.392± 0.395 10.588± 0.289 7 10.318± 0.821 11.201± 0.311## △ 10.629±0.536 11.859± 0.624# △14 10.622± 0.435 10.790± 0.281 11.081± 0.371 12.758± 0.708## △3

表 3 移植后大鼠癲癇發作次數比較(±s,n=6)

表 3 移植后大鼠癲癇發作次數比較(±s,n=6)

注:*與模型組相比較 P＜0.05。◆與 N SCs移植組比較 P＜0.05。▲與 NSCs+BDN F+紅景天苷組 3w比較 P＜0.05。

組別1w 2w 3w 4w模型組 4.33± 1.03 3.67± 1.03 3.33± 0.52 2.83± 0.75 N SCs組 4.17± 0.175 3.67± 0.82 3.12± 0.75 2.17± 0.75 N SCs+ BDNF+紅景天苷組 4.00±0.89 3.50±0.84 2.33±0.82*◆ 0.83±0.91*◆▲

3 討論

在體內及體外大量研究表明,神經干細胞具有多分化功能,但神經干細胞的定向分化研究才剛剛起步,GABA是中樞神經系統中重要的抑制性氨基酸,神經干細胞治療癲癇的最主要的一個機理就是增加抑制性神經元(GABA神經元)的數量,以此來恢復谷氨酸與 r-氨基丁酸之間的平衡,從而減少癲癇的發生。谷氨酸脫羧酶(GAB65)是 GABA能神經元的生物合成限速酶,主要存在于該神經元的軸突末梢內[3],有研究發現,GABA能神經數目變少,則胞內 r-氨基丁酸的釋放量也降低,GAD活性也受到抑制,所以本實驗用GAD65作為 GABA能神經元的標記物,進行 GABA能神經元鑒定。

BDNF屬于神經生長因子家族或神經營養素家族中的一員。BDNF不僅是在維持神經元正常的生理功能起著關鍵作用,而且在中樞神經系統的發育過程中對神經元的生存、分化、生長也起著極為重要的作用。 Viario-AbeJ ó n等[4]研究表明 ,BDNF可使 E16海馬區 bFGF反應性神經干細胞分化為 GABA能神經元的比例增高。另外謝青松[5]等人的實驗可以得知,BDNF還有促進 bHLH基因表達作用,有利于神經干細胞的定向分化。也有人研究發現,一些中藥成分也具有促進神經干細胞分化為神經元的作用。其中主要有紅景天苷,紅景天苷是中藥紅景天的主要有效成分,張維燁[6]等通過研究紅景天苷對神經干細胞作用的研究證實,紅景天苷在體外可以促進神經干細胞向神經元分化。研究也發現,紅景天及其提取物在很多方面對神經系統都有著作用,紅景天苷可以通過抑制細胞的鈣離子超載,降低神經細胞凋亡[7]。另外紅景天苷可以通過增加大鼠嗅球當中的 bFGF以及海馬中神經生長因子的數量,進而提高大鼠的學習以及記憶能力[8,9]。

本實驗結果提示,在體外,BDNF與紅景天苷聯合有利于神經干細胞向神經元方向分化,此外二者聯合有利于GABA能神經元分化;同時二者聯合移植致癲鼠后能減少大鼠癲癇發作的次數。其機制可能是因為紅景天苷通過抑制細胞內鈣離子超載而降低神經細胞凋亡[7],從而減少海馬區受損神經元的死亡。有研究也發現 BDN F能顯著抑制驚厥發作后的神經元壞死和凋亡[10]。可能是在兩者的共同作用下,使癲癇發作后的神經元死亡數量大大減少。另外紅景天苷能增加 bFGF海馬中神經生長因子的數量,而 bFGF通過提高NSCs分裂,而增加移植到體內的神經干細胞的數量,并促使NSCs向神經元方向分化。同樣 ,大量研究顯示 BDN F可誘導神經干細胞向神經元尤其是 GABA能神經元分化并促進其成熟。兩者聯合神經干細胞移植后,可能是在體內紅景天苷大大增加了 BDNF的數量,從而使 GABA能神經元明顯增多,從而對癲癇發作產生的抑制作用,但是具體機制仍有待進一步研究,隨著神經干細胞移植治療神經系統疾病的不斷進展,在癲癇治療上一定會取得更好的結果。

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