連作烤煙根際土壤自毒物質成分分析

陳冬梅，楊宇虹，晉 艷，王海斌，段玉琪，尤垂淮，田衛霞，林瑞余，林文雄

(1.福建農林大學農業生態研究所，福建 福州 350002；2.云南省煙草農業科學研究院，云南 玉溪 653100)

連作障礙(Successive cropping obstacles)是指在同一塊土壤中連續栽培同種或同科的作物時，即使在正常的栽培管理狀況下，也會出現長勢變弱、產量降低、品質下降、病蟲害嚴重的現象[1]。煙草(Nicotianatabacum)是我國最重要的經濟作物之一，也是忌連作的作物，煙草長期連作極易造成病蟲害增多，產量、品質下降，連作障礙是煙草生產中亟待解決的問題。

目前，作物連作障礙的成因可歸納為3個方面，即土壤理化性狀變劣、化感自毒作用和土壤微生物區系的變化[2-4]。據報道，作物連作障礙與根系分泌物中的化感物質密切相關，例如，黃瓜(Cucumissativus)[5]、辣椒(Capsicumfrutescens)[6]、大豆(Glycinemax)[7]和地黃(Radixrehmanniae)等[8]植物的根系分泌物均具有自毒作用，這些自毒物質可以通過影響細胞膜透性、酶活性、離子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白質和DNA表達等多種途徑來影響植物生長。陳冬梅[9]研究發現，自毒物質是導致煙草連作障礙的關鍵因素之一，深入分析煙草連作土壤化學物質成分，對揭示煙草連作障礙機理具有重要意義。然而土壤是一個復雜的體系，土壤化學成分復雜，土壤中自毒物質成分難以分離與鑒定。因此，本研究以連作烤煙12年的土壤為材料，探討烤煙連作土壤與對照土壤自毒潛力及其主要化學物質成分差異，為進一步分離、鑒定煙草自毒物質提供依據。

1 材料與方法

1.1試驗時間、地點 田間試驗于2008-2009年在云南煙草科學研究院玉溪試驗基地進行。

1.2試驗材料 供試烤煙品種為K326。煙田為連作烤煙12年的田地，以未種植過煙草的田地為對照。連作煙田的基本理化指標為：土壤pH值7.96，有機質含量2.03%，水解氮51.2 mg/kg，速效磷63.3 mg/kg，速效鉀164.8 mg/kg，全氮1.12 g/kg，全磷2.16 g/kg，全鉀12.8 g/kg，陽離子交換量57.7 mmol/kg；對照土壤的基本理化指標為：土壤pH值7.89，有機質含量1.98%，水解氮49.8 mg/kg，速效磷61.2 mg/kg，速效鉀167.3 mg/kg，全氮1.08 g/kg，全磷2.05 g/kg，全鉀11.5 g/kg，陽離子交換量56.8 mmol/kg。

采用四分法收集煙草根際土壤和對照土壤，用于土壤自毒潛力分析及化學物質成分檢測。

1.3土壤自毒潛力分析 根際土壤化感自毒潛力評價采用土壤-瓊脂三明治法[10]進行測定，并略做修改。稱取土壤樣品15 g，倒入30 mL冷卻至約45 ℃，質量分數為0.8%的瓊脂溶液，充分混勻，待固化后再加入2 mL質量分數為0.5%的瓊脂溶液覆蓋表面，冷卻后每個培養皿中播入10粒預萌發的萵苣(Lactucasativa)或煙草，設無土處理為對照，5次重復，置于人工氣候箱中。萵苣培養溫度為25 ℃，煙草培養溫度為30 ℃，每天光照12 h(07:00-19:00)。萵苣培養3 d后測定根長，煙草根長在培養10 d后測定。不同土壤的化感自毒潛力，即受體的相對抑制率(Inhibition rate，IR)計算公式為：

IR=(1-處理值/對照值)×100%。

1.4土壤浸提液制備及自毒潛力分析 將土壤風干過2 mm篩，稱取1 000 g加入70%的乙醇2 L，超聲波浸提1 h，重復浸提3次，過濾并濃縮至200 mL，得到5 g/mL的浸提液(即1 mL水溶液中含5 g土壤提取物)。以5 g/mL的浸提液為母液，配制2 g/mL 浸提液，以相同質量濃度的土壤浸提液為對照。每個培養皿中點播10粒預萌發的萵苣或煙草種子后，分別添加5 mL不同土壤浸提液或無菌水，萵苣培養3 d后測定根長，煙草根長在培養10 d后測定。不同土壤浸提液的化感自毒潛力計算同上。

1.5土壤化學物質成分的GC-MS鑒定 不同土壤乙醇提取液硅烷化后，進行GC-MS分析。GC-MS條件：氣相色譜質譜儀為varinaic 240GC-450MS，色譜柱為FactorFourTM:capillary column VF-5ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm。程序升溫(乙醇)：初始溫度60 ℃，以15 ℃/min升至140 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升至200 ℃，保持15 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。總運行時間41.33 min。程序升溫(氯仿)：初始溫度60 ℃，以10 ℃/min升至140 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。總運行時間40.33 min。進樣口溫度220 ℃，載氣：氦(He)，流量0.8 mL/L；進樣量為1 μL。質譜條件：EI電離方式，電子能量70 eV；阱溫200 ℃；阱外套溫度50 ℃；傳輸線溫度280 ℃；掃描范圍50～1 000 amu。用譜圖庫(NIST98 & WILEY)檢索確定各種化合物。

1.6數據分析 采用 DPS統計軟件進行有關數據的統計、方差分析及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1烤煙根際土壤化感自毒潛力分析 土壤自毒潛力分析顯示，對照土壤處理下萵苣、煙草的根長分別為2.22和0.59 cm，連作煙草根際土壤處理下則分別為1.03和0.34 cm(表1)，與對照相比，烤煙根際土壤對受體萵苣及煙草的抑制率分別為53.60%和42.37%。可見連作烤煙根際土壤對受體萵苣及煙草具有較強的化感自毒潛力。進一步分析土壤提取液對受體生長的影響，結果表明，與對照相比，烤煙根際土壤對受體萵苣及煙草的抑制率為45.96%和34.92%，說明烤煙根際土壤提取液對萵苣及煙草根長生長依然具有明顯的化感抑制作用。

2.2烤煙根際土壤化學物質成分分析

2.2.1糖類物質分析 GC、MS分析結果表明(表2)，對照土壤中存在7種糖類物質，而連作煙草根際土壤中僅存在2種糖類物質。可見煙草連作后，根際土壤糖類物質發生顯著變化，種類明顯減少。

2.2.2酸類物質分析 分析結果表明(表3)，對照土壤與連作煙草根際土壤中酸類物質成分差異顯著。對照土壤中存在14種酸類物質，連作煙草根際土壤中僅有3種酸類物質。可見煙草連作后，煙草根際土壤酸類物質種類顯著減少。

2.2.3酯類物質分析 分析結果表明(表4)，對照土壤中存在16種酯類物質，而連作煙草根際土壤中僅存在8種，且連作煙草根際土壤中檢測到的酯類物質在對照土壤中均存在。可見煙草連作后，煙草根際土壤中酯類物質種類明顯減少了一半。

2.2.4其他物質分析 分析結果表明(表5)，對照土壤中檢測到1個醇類物質，連作煙草根際土壤中檢測到12個其他物質。可見煙草連作導致根際土壤物質成分發生明顯變化。

表2 不同處理條件烤煙根際土壤糖類物質成分

表3 不同處理條件烤煙根際土壤酸類物質成分

表4 不同處理條件烤煙根際土壤酯類物質成分

3 討論與結論

連作烤煙根系分泌物具有明顯的自毒作用，能夠顯著抑制煙草幼苗對營養成分的吸收與利用[11]。這與本研究發現連作烤煙根際土壤對受體植物萵苣、煙草幼苗具有明顯的化感自毒作用相一致。此外，本研究的土壤浸提液生物測試結果表明，連作烤煙根際土壤浸提液也具有明顯的化感自毒潛力，這與連作烤煙根際土壤中存在的自毒物質密切相關。本研究通過GC-MS技術分析土壤浸提液化學成分表明，對照土壤中存在7種糖類物質、14種酸類物質、16種酯類物質、1種其他類物質；而連作烤煙根際土壤中存在2種糖類物質、3種酸類物質、8種酯類物質、12種其他類物質。連作烤煙根際土壤中存在的糖類、酸類及酯類物質，在對照土壤中均可找到；連作烤煙根際土壤中則具有特異的12種物質，其中有8種物質與化感自毒作用相關，而對照土壤中僅存在1個醇類物質。香草醛具有較強的化感潛力[12]。洋地黃毒素是一類具有較強毒害作用的毒性物質[13]。水稻(Oryzasativa)根系分泌成分中的雪松醇在較低濃度下即可對受體萵苣具有較強化感潛力[14]。植酮、β-谷甾醇、膽甾烷醇、膽甾烷-3-酮等在一定濃度下也具有較強的化感自毒作用[15-17]。此外，本研究還發現連作烤煙根際土壤中存在特異的化學物質——誘蟲烯，它能夠引誘植物害蟲并對自身生長造成危害[18]。可見煙草長期連作后，根際土壤化學成分發生顯著的變化，土壤中存在大量與煙草自身化感自毒作用相關的物質。

表5 不同處理條件烤煙根際土壤其他類物質成分

綜上所述，煙草長期連作導致其自毒作用加劇，而這種連作障礙加劇可能與煙草連作過程中分泌的自毒物質及昆蟲引誘物有關。土壤是一個復雜的體系，煙草連作過程中自毒物質釋放后需進入土壤，而土壤中存在大量的微生物，自毒物質釋放后是否需經過微生物的吸收轉化，還是直接起作用，土壤中檢測到的自毒物質其自毒作用濃度及范圍是多少，自毒物質對土壤微生物多樣性及土壤酶活性的影響，還有待于進一步深入探討。

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