馬藺種質材料過氧化物酶同工酶酶譜特征分析

李強棟，孟 林，毛培春，張德罡，韓潤英

(1.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070；2.北京市農林科學院北京草業與環境研究發展中心，北京 100097；3.內蒙古通遼市畜牧獸醫科學研究所，內蒙古 通遼 028000)

馬藺(Irislacteavar.chinensis)系鳶尾科鳶尾屬多年生草本宿根植物，在我國北方各省區野生分布廣泛[1]。生長于河灘、鹽堿灘地，為鹽化低地草甸建群種[2]。根狀莖短而粗，根系入土深，須根稠密發達。花淡雅美麗，葉色青綠，柔軟厚實，病蟲害少。耐鹽堿，抗旱抗寒能力強，耐粗放管理。近年來，在我國逐漸被用于恢復生態、水土保持及園林綠化方面，是鹽堿地改良、城市綠地建植、防風固沙、公路護坡和堤壩坡綠化的理想材料；同時，馬藺在藥用、飼用和經濟植物資源方面也具有一定的開發價值[3-5]。在不同生境分布的馬藺種質材料，種子形態和顏色、葉寬及長度、花色及花莖長度等性狀均表現出明顯差異，種質材料間必然存在豐富的遺傳多樣性。

本研究采用非連續垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，檢測收集自我國北方野生分布的23份馬藺種質材料的POD同工酶，探討不同居群馬藺種質材料間遺傳變異與親緣關系，為馬藺種質資源的開發利用提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1試驗材料 以采自我國北方5省區不同生境分布的23份馬藺種質為試驗材料，材料編號、生境、來源和地理信息詳見表1。

1.2試驗方法

1.2.1幼苗培養 于2009年11月在北京市農林科學院草業中心日光溫室進行。在花盆(內口徑21 cm，高18 cm)中裝入3 kg草炭土(依體積比加入過篩土2份，草炭1份)，每個種質材料設4次重復，每重復50粒種子。待生長到4～5片真葉時采樣[4]。

表1 馬藺種質材料

1.2.2酶液提取 剪取從外向內數第3片馬藺幼苗功能葉尖部0.1 g，加入1.5 mL樣品緩沖液(內含0.065 mol/L Tris-檸檬酸,pH值8.2)，剪碎后于冰浴中研磨，研磨后將勻漿迅速倒入離心管，12 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL加入0.25 mL 50%甘油(內含2%溴酚藍)溶液混勻后，放入4 ℃冰箱以備同工酶檢測。

1.2.3制備凝膠 參考何忠效和張樹政[14]的方法，采用高pH-不連續電泳凝膠體系，分離凝膠濃度為7.5%,0.65 mol/L Tris-HCl(pH值8.8)緩沖液;濃縮凝膠濃度為3%,0.125 mol/L Tris-HCl(pH值6.8)緩沖液。

1.2.4電泳 用微量進樣器吸取0.02 mL酶液，加入點樣槽，向電極槽內注入電極緩沖液，接通電源穩壓電泳。當前沿指示劑從濃縮凝膠進入分離凝膠時，將電壓由150 V調至200 V。

1.2.5染色 采用改良聯苯胺法染色[15]。脫色后在凝膠成像系統上掃描同工酶雙波長圖譜峰值，選擇清晰、短促、整齊的膠板拍照。重復5次，選取譜帶最清晰的膠板做進一步分析。

1.3數據處理

1.3.1酶活性 電泳膠板經過染色后，凝膠譜帶的顏色深淺反映POD同工酶活性的強弱。根據譜帶顏色深淺程度的不同，將酶活性強弱劃分為4級。4級：譜帶顏色深，酶活性強；3級：譜帶顏色較深，酶活性較強；2級：譜帶顏色淺，酶活性弱；1級：譜帶顏色最淺，酶活性最弱。

1.3.2電泳遷移率 計算各個譜帶的遷移率(Rf)=X1/X2，式中,X1為固定染色后凝膠中蛋白質譜帶的遷移距離；X2為固定染色前凝膠中指示劑遷移距離[16]。同時，參考酶活性分類等級繪制酶譜模式圖。

1.3.3統計分析 用二元屬性法將電泳所得膠板的帶型視為一個形態性狀進行統計，具有多態性帶出現的賦值為“1”，無帶為“0”，數據輸入NTSYSpc 2.1軟件計算相似性系數并獲得相似性系數矩陣，用非加權組平均法(UPGMA)方法進行聚類分析并生成聚類圖[10,17]。

2 結果

2.1POD同工酶電泳結果 不同生境分布的23份馬藺種質材料POD同工酶譜帶差異性較大，譜帶濃度和擴散程度也不同(圖1)。靠近陰極區域附近的譜帶形成顏色較深、濃度較大和擴散程度大的譜帶；靠近正極區域附近的譜帶形成顏色較淺、濃度較小和擴散程度小的譜帶；處于中間區域的譜帶表現出兩極區域譜帶共有特征，強弱帶多樣分布、譜帶濃度從4至1級變化豐富，初步說明POD同工酶具有較高的多態性。

2.2POD同工酶譜帶特征 由酶譜模式圖分析(圖2)，23份野生馬藺種質材料共出現30條譜帶，各種質材料中出現9條、8條、7條、6條及5條譜帶，分別占供試種質材料的8.7%、34.8%、13.0%、26.1%和17.4%，其中，種質材料BJCY-ML004和BJCY-ML024譜帶數最多(9條)，BJCY-ML001、BJCY-ML018、BJCY-ML021和BJCY-ML29譜帶數最少(5條)。Rf在0.041～0.515位點多態分布，而Rf在0.041位點，BJCY-ML012、BJCY-ML013、BJCY-ML014和BJCY-ML020未檢測出同工酶譜帶，占全部材料的17.4%，其余材料檢測出的譜帶顏色深，活性等級為4與3，表現出強酶活性，多態性強的特征；Rf在0.515位點，僅BJCY-ML004出現酶譜帶，為其特征譜帶。

圖1 23份馬藺種質材料POD同工酶酶譜

圖2 23份馬藺種質材料POD同工酶酶譜模式圖

根據Rf值，將電泳膠板上分布的酶譜帶劃分為4區(由陰極到陽極)，各區Rf范圍及出現的種質材料見表2。參試的23份種質材料的Rf不完全相同，大部分酶活性強譜帶和較強譜帶集中在A區和B區，各個材料譜帶數及酶活性強弱差別較大，由此，通過基因在酶蛋白上的表達反映了種質材料的遺傳特性，初步說明了供試的野生馬藺種質材料存在遺傳差異性。其中：A區(Rf=0.000～0.061)，僅Rf在0.041位點出現譜帶，檢測出譜帶的種質材料占全部材料82.6%，應為馬藺的共有譜帶。同時，在Rf0.041位點，材料BJCY-ML015譜帶顏色淺，活性2級，表現出弱酶活性；材料BJCY-ML011譜帶顏色較深，酶活性3級，表現出較強酶活性；其余材料酶活性顏色深，活性4級，表現出強酶活性。

B區(Rf=0.061～0.258)，10個遷移率位點檢測出譜帶，Rf為0.165、0.216出現譜帶頻率均為70%以上，譜帶出現幾率高，應為馬藺的共有酶譜帶。其中，僅BJCY-ML004在Rf0.227位點出現譜帶，其顏色較深，酶活性較強，分類等級3，出現頻率僅為4%，為BJCY-ML004特征譜帶(出現頻率≤5%)，其余材料Rf在0.082～0.216之間，占全部材料的9%～43%。同時，在B區檢測到的譜帶數變化豐富，最多為4條，如BJCY-ML004、BJCY-ML012、BJCY-ML013和BJCY-ML023等；最少為2條，如BJCY-ML001、BJCY-ML005、BJCY-ML006和BJCY-ML018等，顯示出POD同工酶在馬藺種質資源個體間存在較大遺傳差異性。

表2 酶譜分區

C區(Rf=0.258～0.453)，共15個遷移率位點檢測出譜帶，在Rf0.289、0.325、0.345、0.361、0.392、0.402和0.433位點出現譜帶的頻率分別為70%、17%、52%、30%、39%、13%和39%，出現頻率高，應為馬藺的共有譜帶。在Rf0.299、0.314、0.332、0.368、0.371、0.387、0.418和0.428位點，譜帶出現頻率僅為4%，譜帶酶活性呈現弱及最弱，其中BJCY-ML005呈現3條特征酶帶，BJCY-ML006存在2條特征酶帶，BJCY-ML011、BJCY-ML018和BJCY-ML020各有1條特征酶帶。

D區(Rf=0.453～0.557)，共4個遷移率位點檢測出譜帶，在Rf0.464、0.505和0.515檢測出酶譜的材料占所有供試材料的4%，酶活性呈現弱及最弱，分類等級1、2級，為BJCY-ML004、BJCY-ML005和BJCY-ML033的特征酶帶。BJCY-ML006和BJCY-ML 033分別在遷移率0.485位點檢測到酶帶，酶活性最弱及弱，分類等級1、2級。顯示出不同生境條件下野生分布的馬藺種質具有豐富的遺傳多樣性，存在一定的親緣關系。

2.3聚類分析 相似性系數可反映不同生境和地理位置的種質材料間親緣關系[18]。將譜帶轉化為二元屬性數據，并計算得到相似性系數矩陣(表3)。馬藺POD同工酶相似性系數普遍偏大，為0.516～1.000。其中，BJCY-ML004和 BJCY-ML020間相似性系數最小(0.516)，BJCY-ML028和BJCY-ML031間相似性系數最大(1.000)，其他材料間的相似性系數為0.548～0.968。根據聚類結果(圖3)，以相似性水平0.71為判定標準，將供試的23份馬藺種質劃分為4個一級類群。第Ⅰ類群，共15份種質，再以相似性水平0.76為標準，又可劃分為3個亞類群，其中第一亞類群包括BJCY-ML001、BJCY-ML018和BJCY-ML008；第二亞類群包括BJCY-ML021、BJCY-ML027、BJCY-ML029、BJCY-ML028、BJCY-ML031、BJCY-ML035、BJCY-ML022、BJCY-ML026、BJCY-ML023、BJCY-ML024和BJCY-ML033；第三亞類群包括BJCY-ML005。第Ⅱ類群包括BJCY-ML006和BJCY-ML011。第Ⅲ類群包括BJCY-ML004。第Ⅳ類群包括5份材料，當相似性水平大于0.79時，可劃分為2個亞類群，即BJCY-ML012和BJCY-ML013屬第一亞類群；BJCY-ML014、BJCY-ML015和BJCY-ML020屬第二亞類群。聚類結果反映了不同居群馬藺種質材料與其生境或地理位置存在一定相關關系。

圖3 聚類分析

3 討論

通過基因產物檢測等位基因和基因特定結構，進而從宏觀上探討了微觀結構，可在一定程度上揭示植物系統發生和親緣關系[19]。通過對不同居群馬藺種質資源進行生化、分子水平上的研究，為馬藺遺傳多樣性研究提供理論依據。目前關于馬藺的研究主要集中于生物學特性與生態地理分布、資源和經濟用途綜合論述、栽培技術、破除種子硬實提高發芽率的技術、抗旱性鑒定、組織培養等的研究上[20-25]，對其眾多形態變異類型相關的遺傳變異研究報道較少。DNA分子水平上，采用ALFP技術和ISSR技術分別開展了不同生境條件下野生分布的馬藺種質資源分子遺傳多樣性分析的研究[26-27]，證明了馬藺種質材料間存在豐富的遺傳多樣性，而從生化水平上，研究不同生境條件下馬藺種質材料間同工酶酶譜特征的遺傳變異特性相對較少。另一方面，采用酶電泳技術可以較為容易的計量近緣生物之間遺傳變化，并同時比較多種蛋白質。本研究譜帶濃度變化豐富及部分種質資源特征譜帶的出現，即表明馬藺體內酶蛋白協同多種同工酶適應不同生境，發生了一定的遺傳變異，表現出遺傳多樣性。本研究中23份野生馬藺種質共出現30個遷移率位點，4個酶譜濃度分級，各種質材料中出現9條、8條、7條、6條和5條譜帶，遷移率在0.041～0.515位點多態分布。通過譜帶分析，在A區0.041位點檢測出了82.6%試驗材料全部所具有的基本譜帶，說明不同居群下馬藺種質材料具有共同起源，其他3區總共出現12條多態性特征譜帶(BJCY-ML004和BJCY-ML006,各2條;BJCY-ML005,4條;BJCY-ML011、BJCY-ML018、BJCY-ML020和BJCY-ML033，各1條)。植物受不同生境條件影響，遺傳分子水平發生變異，從而導致同工酶水平發生相應的遺傳差異[28]。POD同工酶在植物不同組織器官、不同發育階段廣泛存在并參與體內多種生理活動，是一種重要的遺傳標記信息[13,29]。

表3 馬藺種質材料POD同工酶相似性系數矩陣

全部種質之間的相似性系數值在0.516～1.000，BJCY-ML004和BJCY-ML020具有較遠的親緣關系，二者的相似性系數最小，為0.516，遺傳差異較大，在探討馬藺起源和演化、種質材料間親緣關系和系統分類方面，可以作為種質資源收集、創新和改良的選擇基礎。聚類分析是數理統計研究中的一種多元分析方法，通過“物以類聚”的思想方法，分析物與物之間的相同點和類與類之間的差異，定量地確定類群或相關指標的親疏關系，從而客觀地分型劃類[30-31]。本研究以POD同工酶相似性系數聚類得到樹狀聚類圖，將23份野生馬藺種質資源劃分為四大類群，所有材料表現出的類群間差異大于類群內差異,這僅僅是從單一的POD同工酶譜帶的特征觀察描述而得，如BJCY-ML021與BJCY-ML027，BJCY-ML022與BJCY-ML026，BJCY-ML012與BJCY-ML013的聚類結果均顯示出與其分布地理位置和生境存在一定的關系。該方法應用于野生馬藺種質資源的數量分類，結合相似性系數大小，在一定程度上可評價其親緣關系的遠近，揭示其遺傳背景的差異。同時，尚需進一步從形態學、生化學和DNA分子標記的角度，綜合分析其遺傳多樣性，揭示其親緣關系和遺傳特性，為馬藺優異種質資源的開發利用提供更為科學客觀的理論基礎。

[1]陳默君，賈慎修.中國飼用植物[M].北京:中國農業出版社，2000:1441.

[2]內蒙古農牧學院.植物分類學[M].第二版.北京:中國農業出版社，2000:198-199.

[3]孟林，張國芳，趙茂林.水保護坡觀賞優良地被植物——馬藺[J].農業新技術，2003(3):38-39.

[4]史曉霞，毛培春，張國芳，等.15份馬藺材料苗期抗旱性比較[J].草地學報，2007，15(4):352-358.

[5]黃忠文，孫廣玉，張慶紅.鹽堿土上馬藺的生長特點和滲透調節能力研究[J].中國農學通報，2005，21(12):199-240.

[6]張雪婷，師尚禮.隴東野生紫花苜蓿的遺傳特異性分析[J].草地學報，2009，17(3):333-348.

[7]田國中，李懷方，裘維蕃.植物過氧化酶研究進展[J].武漢植物學研究，2001，19(4):332-344.

[8]黃壽松，翁堅.幾種植物中的過氧化物酶同工酶分析[J].遺傳，1980，2(3):7-10.

[9]高桂娟，毛凱，干友民，等.牧草和草坪草同工酶研究現狀及存在問題[J].草業科學，2003，20(1):49-52.

[10]熊全沫.同功酶電泳數據的分析及其在種群遺傳上的應用[J].遺傳，1986，8(1):1-5.

[11]萬海清，梁明山，許介眉.分子生物學手段在植物系統與進化研究中的應用[J].植物學通報，1998，15(4):12-17.

[12]Chaparo J X，Wemer D J，O’Malley D.Targeted mapping and linkage analysis of morphological isozyme，and RAPD markers in peach[J].Theoretical and Applied Genetics，1994，87:805-815.

[13]鄒春靜，盛曉峰，韓文卿.同工酶分析技術及其在植物研究中的作用[J].生態學雜志，2003，22(6):63-69.

[14]何忠效，張樹政.電泳[M].北京:科學出版社，1999:280-287.

[15]胡能書，萬賢國.同工酶技術及其應用[M].長沙:湖南科學技術出版社，1985:70-184.

[16]韓天文，張健全.5個蘇丹草品種酯酶同工酶比較研究[J].草業科學，2009，26(10):97-107.

[17]王森山，唐守嶸，朱亞靈，等.抗蚜苜蓿品種(系)SSR標記的遺傳多樣性分析[J].草業科學，2010，27(7):78-83.

[18]孫建萍，袁慶華.利用微衛星分子標記研究我國16份披堿草遺傳多樣性[J].草業科學，2006，23(8):40-44.

[19]李陽春，王玲英.早熟禾屬不同種及生態型POD同功酶分析[J].草業科學，1996，13(5):5-8.

[20]王桂芹.不同生態環境馬藺植物體解剖結構比較[J].內蒙古民族大學學報(自然科學版)，2002，17(2):127-129.

[21]孫躍春.馬藺種子休眠解除技術與適宜萌發條件研究[D].北京:中國農業大學，2004:9-30.

[22]王永春，孫群，丁籽勉，等.促進馬藺種子萌發的前處理方法探討(簡報)[J].草地學報，2009，17(2):264-266.

[23]孟林，毛培春，張國芳.不同居群馬藺抗旱性評價及生理指標變化分析[J].草業學報，2009，18(5):18-24.

[24]劉德福，陳世璜，陳敬文，等.馬藺的繁殖特性及生態地理分布的研究[J].內蒙古農牧學院學報，1998，19(1):1-6.

[25]孟林，肖闊，趙茂林，等.馬藺組織培養快繁技術體系研究[J].植物研究，2009，29(2):193-197.

[26]王康，董寬虎，孫彥，等.馬藺ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J].草地學報，2008，16(6):581-589.

[27]牟少華，彭鎮華，郄光發，等.馬藺種質資源AFLP標記遺傳多樣性分析[J].安徽農業大學學報，2008，35(1):95-98.

[28]陳家寬，楊繼主.植物進化生物學[M].武漢:武漢大學出版社，1994.

[29]Weeden N F，Lamb R C.Genetics and linkage analysis of 19 isozyme loci in apple[J].Journal of the American Society for Horticultural Science，1987，112:865-872.

[30]柴琦，張健全，左昆，等.26個草地早熟禾品種同工酶的譜帶特征[J].草業科學，2008，25(1):31-37.

[31]張彩英，張樹華，孫惠賢.小麥品種資源品質性狀聚類分析[J].河北農業大學學報，1996，19(2):9-13.