中藥提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

李 健，王曉梅

(1.寶雞市人民醫院 腫瘤科，陜西 寶雞 721000；2.寶雞文理學院 化學化工系,陜西 寶雞 721013)

糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，久病可引起多系統的損害，隨著人們生活方式的改變，糖尿病的發病率日趨增高，在治療中，降低餐后血糖以減少并發證的發生是一個重要的方面。中藥治療糖尿病雖然降糖強度較西藥弱，但療效穩定，作用溫和，不良反應少，能有效防治并發證。近年來，從中藥及其提取物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究引起了很多學者的關注并取得了一些進展[1-3]。川芎嗪，化學名為四甲基吡嗪，是從川芎的生物堿中分離得到的有效單體，具有活血化瘀、抗血小板凝集、擴張血管等多種作用，因其治療心腦血管疾病療效好、不良反應少而廣泛用于臨床[4-5]。天麻素是天麻的主要活性成分之一,化學名為對羥甲基苯-β-D-呋喃葡萄糖苷。天麻素具有鎮靜、安眠和鎮痛等作用，并有舒張外周血管、增加心腦血管流量、降低腦血管阻力等作用[6-7]。然而，有關二者對α-葡萄糖苷酶的作用尚未見報道。本課題組就川芎嗪和天麻素對α-葡萄糖苷酶活性的影響進行了實驗觀察，以期對糖尿病藥物的篩選提供實驗依據。

1 實驗材料

注射用磷酸川芎嗪，山東圣魯制藥有限公司，批號：20059313；天麻素注射液，上海現代哈森(商丘)藥業有限公司，批號：20066464；α-葡萄糖苷酶，美國Sigma公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG,純度99%)，美國Merck公司；二甲基亞砜，萊陽化工實驗廠；所用化學試劑均為市售分析純，去離子水自制。

DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司;752N紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；BS-244-SS電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 天麻素和川芎嗪對α-葡萄糖苷酶活性的影響 參照文獻方法[8]測定天麻素和川芎嗪對α-葡萄糖苷酶活性的影響。酶活力單位的定義:37 ℃、pH 6.8條件下，每分鐘水解pNPG釋放1 μmol對硝基酚(pNP)所需的酶量，規定為一個酶活力單位(U)。

取10 mL試管若干，依次加入pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液1.85 mL、0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶50 μL，不同濃度樣品溶液(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mg/mL)50 μL，0.011 6 mol/L pNPG 50 μL，將上述反應體系在37 ℃恒溫水浴保溫30 min后，立即加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液8 mL終止反應，以磷酸鹽緩沖液為參比，在400 nm波長處測吸光度A。樣品終濃度分別為0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5及20 μg/mL，每個濃度同時作3個平行,取平均值。同時測樣品及底物的本底吸光度并于計算時扣除。按照公式計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A樣品為加入樣品后酶促反應的吸光度值，A空白為無樣品時酶與底物反應后的吸光度值，且均為扣除本底吸光度的值。

2.2 抑制物的抑制動力學研究 分別取不同濃度(0、5、15 μg/mL)的樣品溶液，再分別加入不同濃度的底物(濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mol/L)，測定反應速度，用Lineweave-Burk作圖法確定抑制類型。

3 結果

3.1 天麻素、川芎嗪對α-葡萄糖苷酶活性的影響 見圖1。由圖1可知,在一定濃度范圍內，天麻素和川芎嗪溶液對α-葡萄糖苷酶活性均有抑制作用，且抑制作用隨提取物濃度的增大而增大，川芎嗪溶液在20 μg/mL時抑制率達84.0%，IC50值為3 μg/mL。天麻素濃度為2.5 μg/mL時，抑制率為55.9%，天麻素濃度為15 μg/mL時，抑制率達89.1%，之后抑制率無明顯增大。IC50值為2.4 μg/mL。

圖1 天麻素、川芎嗪對α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖2 川芎嗪對α-葡萄糖苷酶抑制機制的判斷

圖3 天麻素對α-葡萄糖苷酶抑制機制的判斷

3.2 川芎嗪對α-葡萄糖苷酶抑制機制的判斷 見圖2。由圖2可知,通過在含不同濃度樣品川芎嗪的測活體系中，改變底物濃度，測定酶促反應的初速度，Lineweaver-Burk雙倒數作圖，得到一組相交于縱軸一點的直線，斜率隨樣品濃度的變化而改變，最大反應速度(Vm)不因樣品濃度的不同而改變，米氏常數(Km)隨著樣品濃度的增大而減小，其抑制機制符合競爭性抑制類型的特征。

3.3 川芎嗪對α-葡萄糖苷酶抑制機制的判斷 見圖3。由圖3可知,通過在含不同濃度天麻素的測活體系中，改變底物濃度，測定酶促反應的初速度，Lineweaver-Burk雙倒數作圖，得到一組相交于左上象限一點的直線，斜率隨樣品濃度的變化而改變，最大反應速度(Vm)因樣品濃度的不同而改變，米氏常數(Km)隨著樣品濃度的增大而減小，其抑制機制既不符合競爭性抑制類型，也不符合非競爭性抑制的特征，當屬于混合型抑制類型。

4 討論

α-葡萄糖苷酶是位于小腸絨毛膜上的消化酶，其將飲食中的淀粉和蔗糖分解為單糖而被吸收。α-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制位于小腸的α-葡萄糖苷酶的活性，使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢，延緩或抑制葡萄糖的吸收，有效地降低餐后高血糖。本實驗的原理是糖苷酶可以與底物PNPG特異性結合，水解PNPG中的α-1，4糖苷鍵并產生PNP，PNP在400 nm波長處有最大吸收峰。

川芎嗪在結構上有多個甲基，且甲基上的氫具有活性，容易與蛋白質的疏水部位結合，在酶促反應體系中，川芎嗪的甲基可能是通過與α-葡萄糖苷酶活性中心的“疏水口袋”結合而減少了底物與酶的結合進而對底物產生競爭性抑制作用。天麻素結構與PNPG結構相似，二者均有苯基和葡萄糖結構，在酶促反應中，天麻素可以與PNPG競爭性結合酶活性中心的必需基團，從而減少了PNP的產生,同時天麻素含有多個羥基，并有甲基，這些基團可能與酶蛋白活性中心以外的基團結合，從而引起變構效應，也阻礙了α-葡萄糖苷酶水解PNPG的進程，由此產生了對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

[1]張冉,劉泉,申竹芳,等.應用α-葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型篩選降血糖中藥[J].中國藥學雜志,2007,42(10):740-742.

[2]Chen H,Feng R,Guo Y,et al.Hypoglycemic effects of aqueous extract of Rhizoma Polygonati Odorati in mice and rats[J].J Ethnopharmacol,2001,74(3):225-229.

[3]Kim YM,JeongYK,WangMH,etal.Inhibitory of pine extract on glucosidase activity and postprandial hyperglycemial[J].Nutrition,2005,21(6):756-761.

[4]李彤,于月明,姜濤.川芎嗪合復方天麻蜜環糖肽片治療慢性腦供血不足臨床研究[J].吉林中醫藥,2009,29(8):667.

[5]徐國良,李海峰,孫楠,等.川芎嗪注射液治療冠心病心絞痛78例臨床觀察[J].長春中醫學院學報,2002,18(6):18-19.

[6]王莉,肖紅斌,梁鑫森.天麻化學成分研究[J].中草藥,2009,40(8):1186-1189.

[7]張華,雛曉東,連新福,等.天麻素臨床應用研究進展[J].光明中醫,2006,21(12):70-72.

[8]Kim J S,Kwon C S,Son K H.Inhibition of alpha-glucosidase and amylase by luteolin,a flavonoid[J].Biosci Biotechnol Biochem,2000，64:2458-2461.