中藥復方對變態反應性鼻炎大鼠鼻黏膜組織Eotaxin-mRNA表達的影響

黃桂鋒，盧健敏，熊大經，謝 慧

(1.泉州市中醫院，福建 泉州 362000；2.泉州醫學高等專科學校，福建 泉州 362000；3.成都中醫藥大學，四川 成都 610075)

變態反應性鼻炎是耳鼻咽喉科常見病，也是常見的呼吸道變應性疾病，并且上下呼吸道炎癥具有密切的一致性和相關性。本病已成為一個全球性的健康問題[1]。變應性鼻炎屬于中醫學“鼻鼽”“鼽嚏”的范疇。眾多醫家認為鼻鼽的發生，由內外病因相應而致。外由風寒濕熱，內因肺脾腎虛，其中又以肺脾失調、脾氣虧虛為主。本實驗從脾虛型AR入手，采用RT-PCR方法，從基因水平上研究中藥復方對實驗性AR大鼠鼻黏膜Eotaxin-mRNA表達及嗜酸性粒細胞的影響，探討中藥復方對脾虛型AR的影響及對該型AR的治療機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SD大鼠70只，SPF級，3月齡，體質量180～220 g，雌雄各半，由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供，許可證號：scxk(川)2006-18，飼養于四川省醫學科學院實驗動物中心，室內溫度控制在20～25 ℃。

1.2 藥物與試劑 中藥復方由成都中醫藥大學附屬醫院制劑室提供。氯雷他啶，卵白蛋白：美國Sigma公司生產。TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑，寶生物工程(大連)有限公司生產。PCR引物，寶生物工程(大連)有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 造模與分組方法 70只大鼠，自由喂養1周后，按體質量、性別隨機分為7組。每組10只。即空白組、脾氣虛AR模型組、脾氣虛AR中藥組、脾氣虛AR西藥組、AR模型組、AR中藥組、AR西藥組。

脾氣虛模型:采用飲食不節加游泳疲勞過度綜合因素傷脾的方法[2]。飲食不節：病證結合組動物單日喂飼甘蘭每只10～15 g，自由飲水;雙日豬脂2 mL/只灌胃，自由進食，飲水，共8 d。過勞傷氣：病證結合組動物在上述處理的當日放入20 ℃水池中游泳至疲勞過度(以驅趕無力游泳或欲溺水為指征)，每日1次，共8 d。

變應性鼻炎模型：按照安云芳等[3]報道的方法造模。實驗組動物以卵白蛋白0.30 mg作抗原，氫氧化鋁粉末30 mg作佐劑，加生理鹽水至l mL形成混懸液，腹腔內注射，隔日1次，共7次。腹腔注射免疫完成后，每側鼻腔均以5%卵白蛋白的生理鹽水溶液20 μL局部免疫，每日1次，共7次。空白組動物用等量生理鹽水代替進行腹腔注射和鼻腔滴注，方法同上。

藥物干預：空白組、脾氣虛AR組、AR組用等量的生理鹽水灌胃，其余各組在局部激發的同時，每日分別予以相應的藥物干預,給藥1 h后再予以5%的卵白蛋白溶液局部半量激發，即5%的卵白蛋白溶液20 μL，每側10 μL滴入大鼠雙側前鼻孔。

2.2 給藥方法 造模結束后，即第22天后開始給藥，根據實驗動物與人用藥量的換算方法計算出用藥劑量[4]。每日以成人臨床劑量8倍的中藥(中藥組)及西藥(西藥組)灌胃，給藥時間為7 d。空白組、AR模型組、脾虛AR模型組:正常喂養，并用相同量的生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標與檢測方法

2.3.1 鼻黏膜Eotaxin-mRNA表達的RT-PCR檢測 實驗結束后,在超凈工作臺上取鼻黏膜用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法,進行Eotaxin-mRNA(信使RNA)水平表達的檢測。具體方法:從美國國立衛生院所維護的國際權威數據庫網站獲得最新版本的SD大鼠Eotaxin和內參基因β-actin的mRNA序列。利用引物設計專業軟件Primer 5.0設計其引物。然后委托大連寶生物工程有限公司完成引物合成。Eotaxin-mRNA引物:5’-AAACCATAAACAACCTCCTC-3’，3’-ATTGACTCCTACTATCCTCCTG-5’，采用美國TriZol試劑(Cat NO: 15596-018)一步法提取總RNA→反轉錄反應→PCR反應，反應結果通過凝膠電泳分析系統檢測。由于反應眾多，為保障不同反應之間的可比性，采用不同反應產物帶的相對熒光強度比值進行橫向比較，確定不同基因在不同樣本的相對表達程度。

2.3.2 鼻中隔黏膜嗜酸細胞(EOS)計數 于末次鼻腔激發后30 min，將大鼠斷頭處死，并將上頜骨從顱骨中游離出來，沿鼻中線剪開鼻腔，暴露鼻中隔，剝離雙側鼻中隔黏膜并按組及時固定于10%中性福爾馬林液內,常規脫水、透明、浸蠟、包埋，石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡進行EOS計數。在高倍視野(40×10倍)下隨意選取鼻中隔黏膜的10個高倍視野，計數每高倍視野下EOS的均數。

3 結果

3.1 用藥后大鼠鼻黏模嗜酸粒細胞計數比較 見表1。

表1 用藥后各組大鼠鼻黏膜嗜酸性粒細胞計數比較(±s,n=10)

3.2 用藥后大鼠鼻黏膜Eotaxin-mRNA相對表達量比較 見表2。

表2 用藥后各組大鼠鼻黏膜Eotaxin-mRNA相對表達量比較(±s,n=10)

4 討論

熊大經教授認為，脾虛為鼻鼽的主要病機。臨床上單純的肺氣虛寒型鼻鼽并不多見，既使是肺氣虛寒型鼻鼽，治療時如果單純從肺論治，不同時兼補脾氣，療效并不理想。因為脾肺為母子相生的關系，不論是“母病及子”還是“子盜母氣”，均可按虛則補其母的原則，以培土生金法治之。故治療應從健脾入手，健脾益氣，培補中土，達到培土生金、益氣固表之目的。

現代醫學[5]認為本病與遺傳密切相關，帶有與變應性鼻炎發病相關基因的個體稱為特應型個體，并且本病的發生與宿主的免疫紊亂有關。從而確立了本病的治療關鍵在于恢復機體的正常免疫機能狀態，改善特應型體質。因此，選用黃芪、白術等補中益氣、健脾除濕；僵蠶等通竅通絡止癢；五味子等益腎止涕。縱觀全方，通過補中益氣、培土生金，達到消除癥狀、改善體質的目的。

嗜酸性粒細胞(EOS)的浸潤是變應性鼻炎炎癥反應的基本病理改變[6]。AR的發病過程可分為2個階段:速發相反應和遲發相反應。40%～50%的AR患者在速發相反應消退后，又會重新出現以鼻塞、鼻漏、噴嚏為主的復發現象，這就是遲發相反應。在鼻部的表現以呼吸道阻力增加為主，與速發相反應相比它的持續時間更長,治療效果差。是以EOS、嗜堿性粒細胞和淋巴細胞在鼻黏膜內大量浸潤為特征。比較而言，EOS在此期間作用最為重要,有研究[7]表明它釋放的白三烯所致的鼻塞效應比組胺更為突出。而且有實驗證實[8]EOS還可能是一些細胞因子,如白細胞介素-3、白細胞介素-5、粒-巨噬細胞集落刺激因子的重要來源。同時EOS又可通過自分泌Eotaxin、RANTES等趨化因子,正反饋促使Th2細胞在炎癥局部的聚集、刺激特異性T細胞克隆的活化與增生、促進EOS的募集、加重EOS炎癥反應，從而使炎癥進一步放大。由此可見,EOS不僅是變應性疾病的主要效應細胞，同時它還在變態反應的級聯放大過程中起著重要的作用。這提示阻斷EOS的作用會緩解變應性疾病的發生。監測EOS水平對判斷AR的嚴重程度及防治均有積極的指導意義。

本實驗結果表明:中藥復方可明顯降低AR大鼠鼻黏膜組織中的EOS計數，該藥理作用與西藥氯雷他啶相似。表明中藥具有抑制EOS在大鼠鼻黏膜浸潤的免疫藥理作用,這可能是該藥治療AR的一個作用機制。

嗜酸性細胞特異性趨化因子(Eotaxin)，主要細胞來源為上皮細胞、內皮細胞和活化的白細胞[9]。Eotaxin的靶細胞主要是EOS，Eotaxin是一種強有力的EOS激活劑,對于EOS具有很強的優先選擇性，特異性趨化EOS并促使EOS的局部浸潤并激活，Eotaxin對淋巴細胞中的Th2亞群也有趨化作用，并促進其分泌T細胞淋巴因子如IL-3、IL-4、IL-5和GM-csF等。因此，國外有關專家推測:Eotaxin通過對Eos、嗜堿粒細胞和Th2細胞的共同調節，從而引發過敏性炎癥反應。Bouchaib等[10]研究發現Eotaxin不僅可以趨化和激活EOS，而且可以通過Eotaxin-CCR3途徑在IL-5的協同作用下促進CD34+干細胞向EOS分化。此外，除EOS高表達Eotaxin的專一性受體CCR3外,嗜堿粒細胞、肥大細胞、Th2細胞、內皮細胞、呼吸道上皮細胞、單核細胞以及樹突狀細胞也表達CCR3并具有功能性作用,因此Eotaxin除作用于EOS外也通過CCR3作用于表達CCR3的其它細胞產生相應的作用[11-13]。我們知道這些細胞也是參與變應性鼻炎發病的重要細胞。本實驗結果發現，變應性鼻炎大鼠鼻黏膜Eotaxin-mRNA的表達明顯高于正常對照組(P<0.01)。用藥后各治療組Eotanxin mRNA表達明顯減弱(P>0.05)。提示中藥可能通過干預Eotanxin mRNA表達，抑制EOS的浸潤，活化和脫顆粒，從而達到治療變應性鼻炎的作用。

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