久瀉寧顆粒對大鼠潰瘍性結腸炎細胞凋亡及其調控蛋白影響的研究

馬少丹，阮時寶，苑述剛

(福建中醫藥大學藥學院 方劑教研室，福建 福州 350108)

潰瘍性結腸炎(UC)是一種以慢性非特異性腸道炎癥為主要病變的疾病，臨床主要表現為腹瀉、腹痛、黏液血便等，多呈慢性反復發作過程[1]。現在UC的特異性致病因素及發病機制均不明確，大多數專家認為是多種因素相互作用的結果，如感染、遺傳、免疫異常等。近年越來越多的研究[2-3]表明，細胞凋亡參與了潰瘍性結腸炎的發病，且淋巴細胞的凋亡減慢和潰瘍性結腸炎的發生關系密切。本實驗觀察了久瀉寧顆粒對大鼠潰瘍性結腸炎腸組織中淋巴細胞凋亡及其調控蛋白的影響，探討久瀉寧顆粒對潰瘍性結腸炎腸黏膜的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體質量為(200±20)g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供；大耳白家兔4只，體質量2.0～2.5 kg，福建中醫學院實驗動物中心提供。

1.2 實驗試劑 久瀉寧顆粒(自備)，補脾益腸丸，批號:Z44023376，廣州陳李濟藥廠生產。弗氏完全佐劑和2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)，(美國Sigma)。細胞凋亡檢測試劑盒，兔IgG、Fas、Fas-L多克隆抗體及免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。儀器：OLYMPUSCX-40顯微鏡(日本奧林巴斯公司),LEICA Qwin圖像軟件分析系統(德國徠卡公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組 清潔級SD大鼠40只，隨機分為4組，每組10只。各組分別為：正常組，UC模型對照組，補脾益腸丸治療陽性對照組，久瀉寧顆粒治療組。

1.3.2 模型所需藥物制備 異種異體抗原：參照許叔云[4]方法稍作改進，取家兔新鮮結腸黏膜組織，勻漿充分后，-20 ℃下冷凍24 h，溶凍后以4 000 r/min離心30 min,取上清液提純，用總蛋白試劑盒雙縮脲法測定蛋白質含量。抗原乳化液:異種異體抗原與弗氏完全佐劑等體積配比。灌腸液:2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)與無水乙醇等體積配比。

1.3.3 模型制作 除正常對照組外，其余各組大鼠在一側足趾皮下注射抗原乳化液,使大鼠獲得8 mg異種蛋白。14 d后，在大鼠腹股溝部位皮下注射抗原乳化液，同樣使大鼠獲得8 mg異種蛋白。至大鼠體內產生抗結腸抗體，禁食24 h后，將大鼠用乙醚麻醉，用硅膠管插入大鼠肛門深約8 cm，局部灌腸1 mL灌腸液。拔出硅膠管后迅速捏緊大鼠肛門8 min,其間不斷搖擺大鼠，使液體在腸道均勻分布，待液體不再從肛門流出，把大鼠放回籠中常規飼養。

1.3.4 給藥方法 正常組和UC模型對照組給等量的飲用水,久瀉寧顆粒組以15 g/kg(相當于60 kg成人的等效劑量)，補脾益腸丸以2 g/kg(相當于60 kg成人的等效劑量)，每日1次，連續灌胃20 d。

1.3.5 標本采集及處理 大鼠灌胃第20天后，斷頭處死，取結腸潰瘍明顯處作病理分析。在結腸病變范圍內剪取一塊約0.5 cm×0.5 cm病變結腸，甲醛固定，石蠟包埋。一部分采用TUNEL染色方法測定細胞凋亡的情況；一部分采用免疫組織化學法檢測Fas、Fas-L、蛋白的表達。

1.3.6 TUNEL染色方法測定細胞的凋亡 取石蠟切片，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以已知陽性切片作陽性對照，在染色過程中用PBS代替TdT反應液作陰性對照，BC1P/NBT顯色，凋亡細胞其細胞核染色為藍黑色。每張切片隨機選取2個視野,分別計數凋亡細胞數和結腸細胞總數，以凋亡細胞數占細胞總數的百分比作為凋亡指數(AI)。

1.3.7 免疫組織化學法檢測Fas、Fas-L蛋白的表達 石蠟切片脫蠟，抗原微波修復，分別滴加兔Fas、Fas-L蛋白的表達多克隆抗體,按免疫組織化學法試劑盒說明書操作，采用LEICA Qwin圖像軟件分析系統進行分析，以細胞質染成棕黃色為陽性細胞。每張切片黏膜和黏膜下層隨機選取2個視野，取陽性細胞積分光密度的均數表示該樣本IOD值,LEICA數字顯微照相機采集圖像計算總陽性細胞數。

2 實驗結果

2.1 大鼠結腸組織的改變 在灌腸3 d后，各造模組大鼠大部分出現稀便，甚至稀水、膿血，肛門周圍潮濕、污穢,精神萎靡，瘦弱拱背。3周后模型組大部分大鼠依然可見稀便或黏液便、精神萎靡等癥狀。病理分析示：肉眼可見結腸腸壁增厚，管腔變粗，黏膜脫落，潰瘍明顯；腺體及腸壁各層可見大量急、慢性炎細胞。鏡下可見血管增生、炎性肉芽腫及淋巴濾胞結構。補脾益腸丸組大鼠大部分無腹瀉或腹瀉輕微。病理分析示：可見腺體結構出現，一層上皮組織蓋住潰瘍。結腸肉眼觀黏膜水腫較輕，潰瘍和炎性滲出物較少見；鏡下結腸結構基本正常。久瀉寧顆粒組大鼠大部分無腹瀉或腹瀉輕微。病理分析示：上皮組織基本完整，腺體排列較規則，潰瘍基本愈合。正常對照組：大鼠結腸黏膜上皮完整，連續，腺體排列規則，結構清楚。

2.2 TUNEL染色結果 TUNEL陽性表達為細胞核著色為棕褐色。正常大腸組織僅可見腸黏膜有散在陽性表達，量很少。模型組大鼠腸黏膜陽性細胞數目較多，核染顏色較深。久瀉寧顆粒組和補脾益腸丸組陽性細胞的數目較模型組顯著減少。

2.3 各組Fas和Fas-L蛋白的表達 見表1。

表1 各組Fas和Fas-L蛋白的表達(±s)

3 討論

細胞凋亡是指在某些生理或病理因素誘導下，激活膜信號系統，啟動自身內部機制，主要通過內源性DNA內切酶的激活而發生的自然死亡現象[5]。凋亡對生命的正常發育、生長及維持內環境穩定都有著重要的作用。細胞凋亡是由參與細胞凋亡的系列基因相對表達程度決定的，并受多種細胞因子的影響。其中Fas/Fas-L為細胞凋亡發生的重要途徑。UC發病時Fas/Fas-L表達均顯著升高，說明細胞凋亡是UC發生的重要因素，實驗結果亦證實了此種理論。

久瀉寧顆粒由淮山藥、野麻草、白芍、荷葉、防風、砂仁、甘草等藥物組成。淮山藥補脾養胃，生津益肺，補腎澀精，善治脾虛泄瀉；野麻草清熱利濕，消腫解毒為有效的止痢藥、止血藥；2藥配伍共為君藥。白芍平肝止痛，養血調經，斂陰止汗；荷葉清熱解暑,升發清陽，涼血止血；2藥共為臣藥，與君藥配伍,可增強本方健脾滲濕之功。防風、砂仁均為方中佐藥。防風可發表散風，勝濕止痛，止痙、止瀉；砂仁可化濕開胃，溫脾止瀉，理氣安胎；防風與白芍配伍取痛瀉要方之義以補脾土而柔肝木，配伍砂仁則溫脾理氣以緩痛瀉。甘草可補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥，為使藥。全方配伍以健脾滲濕，調氣止瀉為法，標本兼治，不寒不燥，實為治療慢性泄瀉之良方。本實驗表明，久瀉寧顆粒可能是通過調節結腸黏膜層淋巴細胞中Fas、Fas-L表達而影響結腸黏膜固有層淋巴細胞凋亡，達到緩解UC的目的。

[1]WilksS.Them orida ppearance ofthein testineo fmissb anks[J].MedicalTu nesand Gazete,1859(2):264.

[2]白文生,任秀萍.細胞凋亡在組織損傷中的作用及意義[J].臨床薈萃,2002,17(23):1419-1421.

[3]Ueyama H,Kiyohara T,Sawada N，et al.High fas ligand expressionon lymphocytes in lesions of ulcerative colitis[J].Gut,1998,43(1):48-55.

[4]許叔云.藥理實驗方法學[M].3版.北京:人民衛生出版社,2002:1335-1336.

[5]王紅偉,徐華明.針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦細胞凋亡的影響[J].河南中醫學院學報,2007,27(6):21-22.