ZPSJ復方對ICV-STZ模型大鼠海馬組織蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的影響

第五永長，李耀輝，蘇露煜

(1.陜西中醫學院中醫臨床醫學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫醫院，陜西 西安 710061)

腦組織蛋白激酶與蛋白磷酸酯酶之間的平衡失調是導致tau蛋白過度磷酸化從而形成阿爾茨海默病(AD)病理改變細胞內神經元纏結(NFT)的重要途徑之一,本實驗以側腦室注射鏈脲佐菌素(ICV-STZ)的方法復制散發性老年性癡呆(SAD)模型,以燥濕解毒，助脾散精之中藥復方ZPSJ提取物進行干預,觀察ZPSJ復方對SAD模型大鼠海馬組織重要的蛋白激酶糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和蛋白磷酸酯酶-2(PP-2A)的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠28只，體質量(270±20)g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供(實驗動物合格證號:0034642)。所有大鼠隨機分為假手術組、模型組、多奈哌齊組、ZPSJ治療組，均飼養于屏障環境實驗動物室(使用許可證:SYXK【陜】2007-2010)。實驗過程中動物自由攝食和飲水(術前禁食除外),室溫22～26 ℃，濕度為30%～40%。

1.2 藥品與試劑 ZPSJ方：由人參、蒼術、黃連等藥物組成，提取物由陜西中醫學院附屬醫院制劑中心提供；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)：Merck公司；GSK-3β抗體、PP-2A抗體：武漢博士德生物工程公司；多奈哌齊：由中美合資西安海欣制藥有限公司生產，藥物購自第四軍醫大學西京醫院藥房(產品批號：091201)。

1.3 ICV-STZ擬AD模型制備 參考Sharma等[1]的方法，所有大鼠經10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后，固定于江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀上，常規消毒皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜，錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜。除假手術組外，其余動物均用微量注射器每側側腦室各注射STZ約18 μL(3 mg/kg，注射前將STZ溶于人工腦脊液,濃度為25 mg/mL)。坐標參考包新民《大鼠腦立體定向圖譜》[2]：前囟后1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm，腦表面下3.5 mm。第3天重復注射，劑量同前。假手術組以等量人工腦脊液替代STZ。術后常規飼養21 d進行行為學測試后取材。

1.4 腦組織樣品處理 每組隨機選取6只大鼠進行灌注固定：按4.0 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。動物麻醉成功后，將其仰臥于平臺上，伸展固定四肢，剪開胸腹充分暴露心臟和肝臟。迅速插導管于左心室至升主動脈并固定，同時剪開右心耳。快速灌注生理鹽水100 mL至肝臟完全變白，右心室流出澄清液體后，更換4%多聚甲醛先快后慢繼續灌注30 min，然后斷頭，完整取出鼠腦，置固定液中，24 h后行石蠟包埋切片。每只大鼠海馬CA1區出現后連續冠狀切片，放入0.01M PBST的溶液中進行免疫組化染色。

2 結果

2.1 GSK-3β免疫組織化學染色結果 見表1。

表1 各組大鼠海馬CA1區GSK-3β的表達情況(±s,n=6)

2.2 PP-2A免疫組織化學染色結果 見表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區PP-2A的表達情況(±s,n=6)

3 討論

目前公認,AD的病理特征主要為大腦局部尤其是海馬和皮層神經元退行性病變,細胞內神經原纖維纏結(NFT)和細胞外老年斑(SP)沉積。決定AD認知損害癥狀的關鍵在于細胞內NFT的形成，而腦組織tau蛋白過度磷酸化是NFT的形成的源頭。在腦內,tau蛋白磷酸化受到多種因素的調節,其中蛋白激酶與蛋白磷酸酯酶之間的平衡失調是導致tau蛋白過度磷酸化的重要途徑[3]。

近年研究認為，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是AD腦內引起tau蛋白異常過磷酸化的最主要蛋白激酶，對tau蛋白的磷酸化起著非常重要的催化作用。而與此過程相反,蛋白磷酸酯酶催化著tau蛋白的去磷酸化反應，tau蛋白的過度磷酸化可由于蛋白磷酸酯酶活性降低或數量減少而引起。其中，最引人注目的當屬蛋白磷酸酯酶-2中的PP-2A,PP-2A活性的降低可能是導致AD腦內tau蛋白以及其他蛋白過度磷酸化的主要原因。

近年來，tau蛋白磷酸化作為AD防治的新靶標越來越得到重視，其中中草藥在抑制tau蛋白磷酸化防治AD病理改變方面顯示了令人鼓舞的作用。如人參中Rb1可以通過CDK5以及JNK/p38途徑減輕Aβ25-35誘導的tau蛋白過度磷酸化[4]等;知母皂苷B也可通過緩解Aβ對信號轉導通路的抑制，減輕tau蛋白的異常磷酸化[5]。從中藥吳茱萸未成熟果實中提取的去氫吳茱萸堿(DHED)可通過抑制GSK-3β活性從而降低tau蛋白的磷酸化[6]。

本實驗從“脾腦相關”的理論出發，以具有燥濕解毒，助脾散精作用的中藥復方ZPSJ提取物為干預藥物，采用ICV-STZ擬SAD模型進行觀察，結果表明:ICV-STZ模型大鼠腦組織GSK-3β陽性表達的神經元明顯增多，而PP-2A陽性表達的神經元明顯減少，經過ZPSJ復方治療后，大鼠腦組織GSK-3β表達明顯減少,PP-2A表達明顯增加,與之相對照的西藥多奈哌齊則無此作用。本結果提示: ZPSJ復方可能通過調節腦組織GSK-3β和PP-2A的表達及其平衡而影響到tau蛋白的異常過度磷酸化,推測上述結果可能是復方中多種成分的協同作用。有關該方潛在的影響tau過度磷酸化防治SAD認知損害的深層次機制，有必要進一步深入研究。

[1]Tauheed Ishrat,Kehkashan Parveen,Mohd.Moshahid Khan,Gulrana Khuwaja,M.Badruzza-man Khan,Seema Yousuf,Ajmal Ahmad,Pallavi Shrivastav and Fakhrul Islam.Selenium pre-vents cognitive decline and oxidative damage in rat model of streptozotocin-induced experim-ental dementia of Alzheimer’s type[J].Brain Research,2009(1281):117-127.

[2]George Paxinos Charles Waston著,諸葛啟釧譯.The Rat Brain in stereotaxic coordinates(大鼠腦立體定向圖譜)[M].3版.北京:人民衛生出版社,2005.

[3]Patrice Delobel,Isabelle Lavenir,Graham Fraser,et al.Analysis of Tau Phosphorylation and Truncation in a Mouse Model of Human Tauopathy Analysis of Mouse Tauopathy[J].AJP January 2008,172,123-131.

[4]宋錦秋,陳曉春,張靜,等.人參皂苷Rb1通過JNK-p38 MAPK途徑減輕Aβ25-35誘導的胎鼠皮層神經元tau蛋白過度磷酸化[J].藥學學報.2008,43:29-34.

[5]鐘雷,譚潔,歐陽石,等.知母皂苷B對大鼠海馬注射Aβ25～35致tau蛋白磷酸化的影響[J].南方醫科大學學報,2006,26(8):1106-1109.

[6]Peng JH,Zhang CE,Wei W,Hong XP,Pan XP,Wang JZ.Dehydroevodiamine attenuates tau hyperphosphorylation and spatial memory deficit induced by activation of glycogen synthase kinase-3 in rats[J].Neuropharmacology.2007;52:1521-1527.