陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛乳的成分和脂肪酸組成的影響

張養東 王加啟 胡 濤 李珊珊 卜登攀 金 迪 孫 鵬 周凌云

(1.東北農業大學動物營養研究所，哈爾濱 150030;2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛乳的成分和脂肪酸組成的影響

張養東1，2王加啟2*胡 濤2李珊珊2卜登攀2金 迪2孫 鵬2周凌云2

(1.東北農業大學動物營養研究所，哈爾濱 150030;2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

本試驗旨在研究陰外動脈灌注脂多糖(LPS)對泌乳奶牛乳成分、乳脂合成前體物和脂肪酸組成的影響。選用6頭處于泌乳期第(185±30)天、體重(576±36)kg的經產的荷斯坦奶牛，隨機分成2組。采用交叉試驗設計，試驗組陰外動脈灌注LPS(Escherichia coliO111∶B4，0.01μg/kg BW)，對照組灌注生理鹽水。試驗分2期，每期試驗7 d，2期間隔14 d。結果表明:泌乳奶牛干物質采食量受LPS影響差異不顯著(P＞0.05);LPS顯著提高乳中乳蛋白率(P＜0.05)，對乳脂率無顯著影響(P＞0.05);LPS極顯著降低血漿中乳脂合成前體物非酯化脂肪酸的含量(P＜0.01)，β－羥丁酸含量呈先降低后升高的趨勢(P＞0.05);LPS不同程度地降低了乳脂中飽和脂肪酸(P＞0.05)和短鏈脂肪酸(P＞0.05)的含量，提高了乳脂中不飽和脂肪酸(P＞0.05)和中長鏈脂肪酸(P＞0.05)的含量，并影響脂肪酸的去飽和作用。結果提示，LPS是誘發乳脂合成發生變化的主要激發因子之一。

陰外動脈;泌乳奶牛;脂多糖;乳成分;乳脂肪酸組成

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌崩解時釋放的一種主要成分，是誘發動物機體產生炎癥反應的主要誘因之一［1－3］，在機體發生炎癥反應的同時，機體脂類代謝也受相應的調控［4－5］。在嚙齒類動物上的研究發現，LPS能調控乳腺中乳脂肪合成的關鍵酶，如脂肪酸合成酶和乙酰輔酶羧化酶等［6－7］，下調脂蛋白脂肪酶的活性［8］，從而抑制乳腺吸收脂肪酸用于乳脂肪的合成［9］。但目前LPS影響乳腺內乳脂肪合成的研究僅局限于嚙齒類動物，在反芻動物上，更多是局限于將LPS作為乳腺內乳房炎的激發因子基礎上的研究。Zebeli等［3］研究表明，隨著泌乳奶牛飼糧中谷物比例的不斷提高，瘤胃中的LPS隨之上升，LPS不但介導了機體的炎癥反應，且與瘤胃中乳脂率呈負相關，LPS可能是預防反芻動物乳脂降低綜合癥的一種新的舉措［3］;但LPS在降低乳脂的同時，對乳脂脂肪酸組成的影響卻鮮有研究。同時，LPS在胃腸道中遷移位點研究不盡一致，有研究者認為LPS是從瘤胃遷移到外周血液中［10］，也有研究者認為LPS是從腸道尤其是腸道末端遷移到外周血液中［11－13］。因此，本試驗在避開反芻動物胃腸道的基礎上，直接通過陰外動脈灌注LPS更加直觀的研究LPS對乳脂脂肪酸組成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗飼糧

選用6頭泌乳期第(185±30)天，體重(576±36)kg的經產的荷斯坦奶牛，以玉米、豆粕、麥麩、青貯、苜蓿干草及羊草為主要原料配制基礎飼糧，滿足中國農業行業標準(NY/t 34—2004)推薦的營養需求。飼糧組成及營養水平見表1。

表1 飼糧組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the diet(DM basis) %

1.2 試驗設計與飼養管理

1.2.1 灌注液準備

生理鹽水灌注液:10 m L生理鹽水(無致熱源的滅菌生理鹽水)。

LPS 灌注液:LPS(Escherichia coliO111∶B4，美國sigma公司)用生理鹽水配制成0.5 mg/m L儲備溶液，再用生理鹽水按照0.01μg/kg BW 配制成終體積10 m L LPS溶液。

1.2.2 試驗設計

試驗采用交叉試驗設計，6頭奶牛隨機分成2組，每組3頭，試驗按時間順序為7 d預試期，7 d第1正試期，14 d間隔期，7 d第2正試期。預試期內奶牛接受1次陰外動脈生理鹽水灌注，使動物機體適應灌注條件，減輕灌注對動物機體的應激。

第1正試期一組奶牛灌注LPS 0.01μg/kg BW(LPS組)，另一組為對照組，奶牛灌注生理鹽水10 m L;第2正試期，2處理交叉。于正試期第1天07:00灌注。

配制好的溶液經預熱達到37℃時，經右側陰外動脈一次性灌注，灌注時要盡量保持試驗動物安靜，必要時給試驗動物套上“防踢棒”，灌注緩慢而均勻進行，在5 m in內灌注完畢，隨后再用10 m L無致熱源的滅菌生理鹽水沖洗灌注管道，以保證灌注液全部進入試驗動物動脈血管中。

1.2.3 飼養管理

試驗動物采用栓系式飼養，日飼喂2次(07:00和19:00)，自由飲水，擠奶采用利拉伐手推式擠奶機進行。試驗期間每天記錄采食量和產奶量，并觀測試驗動物的精神狀態。

1.3 樣品的采集與測定方法

生鮮乳樣品的采集:于灌注后 0、6、12、24、36、48、60、72、84、96 h 分別采集生鮮乳樣。乳樣分為2份，一份添加防腐劑(bronopol tablet，加拿大D＆F Control System公司)，4℃保存，用于測定乳成分。另一部分－20℃保存，用于乳脂脂肪酸組成測定。

血漿樣品的采集:于灌注后 0、6、12、24、72 h分別利用真空采血管(血漿管)采集尾動脈血樣，4℃靜置過夜后，3 000×g、4℃離心15 m in分離血漿。分離后的血漿于－20℃保存。

乳脂肪含量、乳蛋白質含量利用Foss-MilkoscanTMMinor乳成分分析儀(Minor Scan FOSS，丹麥)測定。利用正己烷與異丙醇的混合液提取牛奶上清液中的脂肪，然后對溶有脂肪的正己烷液體進行酸堿甲酯化，再測定脂肪酸組成，具體方法參見 Bu 等［14］文獻。

血漿中非酯化脂肪酸(NEFA)和β－羥丁酸(BHA)的測定采用 Beckman Synchron CX5PRO分析系統，試劑盒購自英國RANDOX公司。

1.4 數據處理

所有數據以SAS 8.2軟件M IXED模塊進行統計學檢驗。統計模型中包含試驗牛的隨機因素以及試驗期、試驗處理、試驗時間和試驗處理與試驗時間的交互效應等的固定因素。變量的統計結果均以最小二乘均數形式列表，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

2 結果

2.1 陰外動脈灌注 LPS對泌乳奶牛干物質采食量和乳成分的影響

由表2可知，泌乳奶牛干物質采食量受LPS影響差異不顯著(P＞0.05)。灌注LPS顯著提高乳蛋白率(P＜0.05)，對乳脂率無顯著影響(P＞0.05)。

表2 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛乳成分的影響Table 2 Effects of infusion LPS into external pudendal artery on m ilk com position in dairy cow s

2.2 陰外動脈灌注LPS對泌乳奶牛動脈血漿中乳脂合成前體物的影響

由表2和圖1可知，與對照組相比，陰外動脈灌注LPS極顯著降低血漿中乳脂合成前體物非酯化脂肪酸的含量(P＜0.01);對血漿中乳脂合成前體物BHA有增加趨勢(P＞0.05)，但隨著灌注后時間的延續呈先降低后升高的趨勢(P＞0.05)。

表3 陰外動脈灌注脂多糖對動脈血漿中乳脂合成前體物的影響Table 3 Effects of infusion LPS into external pudendal artery on contents of synthesis precursors ofm ilk fat in artery plasma of dairy cows

圖1 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛動脈血漿中乳脂合成前體物β－羥丁酸的影響Fig.1 Effects of infusion LPS into external pudendal artery on the content of BHA in artery plasma of dairy cow s

2.3 陰外動脈灌注LPS對泌乳奶牛乳脂肪酸組成的影響

由表4可知，與對照組相比，陰外動脈灌注LPS降低了乳脂中飽和脂肪酸的含量(P＞0.05)，提高了乳脂中單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和總不飽和脂肪酸的含量(P＞0.05)。陰外動脈灌注LPS降低了乳脂短鏈脂肪酸的含量(P＞0.05)，增加了中鏈脂肪酸和長鏈脂肪酸的含量(P＞0.05)。

2.4 陰外動脈灌注LPS對泌乳奶牛乳脂去飽和指數的分析

由表5可知，與對照組相比，陰外動脈灌注LPS 增加了 C16∶1/C16∶0、C18∶1/C18∶0 和c-9，t-11-CLA/t-11-C18∶1(P＞ 0.05)，降低了 C14∶1/C14∶0(P＞0.05)。

表4 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛乳脂肪酸組成的影響Table 4 Effects of infusion LPS into external pudendal artery on m ilk fat constituents in dairy cows

3 討論

3.1 陰外動脈灌注LPS對泌乳奶牛乳成分的影響

研究發現，谷物誘導的泌乳奶牛亞急性瘤胃酸中毒隨著誘導時間的延續，外周血漿中LPS含量隨之升高，12 h后達到每毫升0.81內毒素單位(endotoxin unit)［12］;乳汁中乳脂率受到顯著抑制(P＜0.01)，但有增加乳蛋白率的趨勢(P=0.08)［15］。本試驗結果與之相似，雖然本試驗陰外動脈灌注的LPS劑量與Khafipour等［12］報道的血液中LPS含量相近，但本試驗在抑制乳脂合成上未達到顯著差異(P＞0.05)，極顯著提高了乳汁中的乳蛋白率(P＜0.01)。這可能與試驗動物的泌乳階段有關，Khafipour等［12］選用的試驗動物為泌乳盛期奶牛［第(84±29)天］，而本試驗選用的試驗動物為泌乳中后期的奶牛［第(185±30)天］。

表5 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛去飽和指數分析Table 5 Effects of infusion LPS into external pudendal artery on the de-saturated indices in dairy cows

3.2 陰外動脈灌注LPS對泌乳奶牛乳脂合成前體物的影響

乳汁C4～C15、50%的C16脂肪酸是乳腺內源合成的脂肪酸，乳汁中50%的C16和C16以上的脂肪酸是乳腺直接從血漿中攝取轉運［16］。內源合成的脂肪酸的前體物為瘤胃發酵產生的BHA和乙酸，乳腺攝取的脂肪酸來源于血漿中NEFA和富含三酰甘油的脂蛋白［17］。本試驗結果表明，陰外動脈灌注LPS顯著降低了泌乳奶牛動脈血漿中NEFA濃度(P＜0.05)，這與乳汁中乳脂率的降低相吻合;血漿中的BHA濃度(P＞0.05)雖然有所增加，但隨著灌注時間的延續，呈現先降低后升高的趨勢，這與Waldron等［18］報道結果相同，Waldron等［18］研究發現，泌乳初期奶牛乳腺內注射LPS時，血漿中NEFA濃度和BHA濃度極顯著降低(P＜0.01)，血漿中BHA濃度在注射后9 h達到最低［18］;本試驗血漿中BHA濃度在灌注后6 h達到最低，這可能與采樣時間點不同有關。但Myers等［19］和 Husier等［20］分別在豬、犢牛上試驗發現，LPS未能顯著影響血液中NEFA的濃度(P＞0.05)。這可能與試驗動物的區別有關，本試驗選擇試驗動物為泌乳奶牛，血漿中NEFA除用于生理活動外，還用于乳的生產，而Myers等［19］和Husier等［20］選擇的試驗動物豬、犢牛血漿中NEFA主要用于生理活動。

3.3 陰外動脈灌注LPS對泌乳奶牛乳脂肪酸組成的影響

研究發現，高精料飼糧條件下瘤胃液pH降低，革蘭氏陰性菌溶解，釋放大量的LPS［11－12，21－23］，可能降低了脂類水解［24－25］，加快食糜外流速度，縮短微生物對不飽和脂肪酸的作用時間，因此降低了生物氫化效率［26］，增加了乳中不飽和脂肪酸的含量［24，27］。本試驗結果也證實LPS影響乳脂脂肪酸的組成，增加了乳脂中不飽和脂肪酸的含量。雖然以前的研究重點在飼糧經瘤胃、肝臟、乳腺直到乳汁等一系列過程中發生的變化，LPS是否是主要的增加乳中不飽和脂肪酸的因子有待研究，本試驗越過瘤胃、肝臟等復雜的器官，直接從供給乳腺供血的陰外動脈灌注LPS研究其對乳脂中乳脂肪酸的影響，結果證實了LPS是引起乳脂中不飽和脂肪酸提高的主要誘因之一。

3.4 陰外動脈灌注LPS對泌乳奶牛乳脂中去飽和指數的分析

不飽和脂肪酸的去飽和作用需要△去飽和酶系的參與［28］，而乳腺中△9去飽和酶活性可用C14∶1/C14∶0、C16∶1/C16∶0、C18∶1/C18∶0 和c-9，t-11-CLA/t-11-C18∶1 等間接反映［29］。本試驗結果表明，與對照組相比，陰外動脈灌注LPS組提高了 C16∶1/C16∶0、C18∶1/C18∶0 和c-9，t-11-CLA/t-11-C18∶1，這與乳脂脂肪酸中不飽和脂肪酸的含量提高相吻合;但C14∶1/C14∶0卻有降低的趨勢，這可能是C14∶1是短鏈脂肪酸，血漿中合成前體物供給不足所致，具體原因待進一步研究確證。

4 結論

本試驗條件下，LPS影響乳汁中乳成分組成、乳脂合成前體物的生成以及乳脂肪酸的含量與比例，是誘發乳脂合成發生變化的主要激發因子之一。

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*Corresponding author，professor，E-mail:wang-jia-qi@263.net

(編輯 王智航)

Infusion of Lipopolysaccharide into External Pudendal Artery of Lactating Dairy Cows:Effects on Milk Composition and Milk Fat Constituents

ZHANG Yangdong1，2WANG Jiaqi2*HU Tao2LIShanshan2BU Dengpan2JIN Di2SUN Peng2ZHOU Lingyun2
(1.Institute of Animal Science，Northeast Agricultural University，Harbin150030，China;2.Institute of Animal Science of the Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China)

The study was designed to evaluate m ilk composition，content of synthesis precursors and m ilk fat constituents in response to the infusion of lipopolysaccharide(LPS)into external pudendal artery of lactating dairy cows.Six multiparous Holstein cows［(185±30)days of lactation，BW=(576±36)kg］were random ly divided into two group.A crossover trial design was used in the study，and cows in experimental group and control group were infused LPS(Escherichia coliO111∶B4，0.01 μg/kg BW)and physiological saline into external pudendal artery，respectively.The study consisted of 2 experimental periodswith 7 d each and a 14-day-interm ission between.The results showed as follows:dry matter intake(DM I)was not significantly affected by LPS challenge(P＞0.01);m ilk protein percentage was significantly increased(P＞0.05)，but m ilk fat percentage was not significantly affected by LPS challenge(P＞0.05);LPS challenge also significantly reduced the plasma non-esterified fatty acid(NEFA)content(P＜0.01)，which was the synthesis precursor ofm ilk fat，meanwhile，the hydroxybutyric acid(BHA)content tended to decrease at first and then increase(P＞0.05);by the challenge of LPS，the contents of saturated fatty acids(P＞0.05)and short-chain fatty acids(P＞ 0.05)were decreased，but the ones of unsaturated fatty acids and m iddle-chain fatty acids were increased(P＞0.05)，in addition，the desaturation of fatty acidswas also affected.It can be concluded that LPS is one of the major factors in affecting m ilk fat synthesis.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(8):1317-1323］

external pudendal artery;lactating dairy cow;lipopolysaccharide;m ilk composition;m ilk fat constituents

S823

A

1006-267X(2011)08-1317-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.08.010

2011－03－08

張養東(1982—)，男，山東濟寧人，博士研究生，從事反芻動物營養與牛奶質量研究。E-mail:zyd1982@yahoo.cn

*通訊作者:王加啟，研究員，博士生導師，E-mail:wang-jia-qi@263.net