不同植物油脂對體外培養條件下培養液酶活及微生物活力的影響

王 曙 王夢芝* 盧占軍 董淑紅 張 鑫 王洪榮

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009;2.贛南師范學院，贛州 341000)

不同植物油脂對體外培養條件下培養液酶活及微生物活力的影響

王 曙1王夢芝1*盧占軍2董淑紅1張 鑫1王洪榮1

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009;2.贛南師范學院，贛州 341000)

本文旨在研究不同飽和程度的植物油脂對體外培養條件下培養液酶活及微生物活力的影響。試驗以3頭裝有瘤胃瘺管的山羊提供瘤胃液，采用單因子試驗設計，對照組不加油脂，試驗組分別添加花生油、菜籽油、玉米油和豆油進行體外培養。結果表明:乳酸脫氫酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶3種酶的活性都以菜籽油組最高，豆油組、玉米油組、花生油組依次降低，除花生油組外，其他試驗組均顯著高于對照組(P＜0.05)，且試驗組間存在顯著差異(P＜0.05)?？偯摎涿敢远褂徒M最高，顯著高于對照組(P＜0.05)，并依次顯著高于玉米油組、花生油組和菜籽油組(P＜0.05)。此外，油脂組原蟲DNA、細菌DNA、微生物DNA、原蟲/細菌區系比例的均值與對照組，以及試驗組間差異均不顯著(P＞0.05)，但隨著培養時間的延長其動態變化模式不盡相同。微生物DNA在各時間點都以豆油組與玉米油組的較高;而原蟲/細菌比例則以豆油組和玉米油組較低。綜上所述，飽和程度不同的油脂對體外培養瘤胃微生物區系及其微生物細胞活力影響不同，其中以豆油促進微生物活力的效應最佳，玉米油較好。

油脂;瘤胃微生物;轉氨酶;脫氫酶;體外

油脂作為能量飼料，對畜禽生產至關重要。但有報道認為，不飽和的油脂使用超過一定的量時，其降解產生的游離脂肪酸的不飽和鍵將會毒害瘤胃原蟲和部分細菌，減少微生物的群體量并可能改變其群體結構，進而影響正常的微生物代謝與瘤胃發酵［1-2］。若能夠借助油脂的這種負面效應，科學使用油脂，則可能達到在一定程度上抑制原蟲群體量和其對細菌的吞噬力，進而增加細菌量、降低原蟲與細菌區系比例、提高微生物生物總量，促進瘤胃發酵的效果。研究表明，各區系微生物(細菌、原蟲、真菌和甲烷菌)因各自特點而對不飽和油脂的響應也不盡一致，如沒有體壁的原蟲對油脂較其他微生物為敏感［1］，本實驗室前期對微生物微循環的研究也發現適量比例、且適當結構的油脂能夠抑制原蟲吞噬細菌的微生物再循環、增加了細菌生物量，對原蟲和細菌區系有一定的控調效應［3］。因此，利用廣泛易得、經濟實用的油脂能量飼料作為瘤胃調控劑，增強瘤胃內酶和微生物活性、促進發酵，而最終實現飼料碳素、氮素的利用效率和宿主動物的生產力是可行而又實踐意義的。關于油脂的研究多以影響瘤胃的微生物、發酵、甲烷產量等為主［4-6］，迄今尚未見關于影響微生物轉氨酶、脫氫酶等細胞活力方面的研究報道。鑒于此，本試驗擬選用4種植物油脂分別進行體外培養，測定體系中轉氨酶、脫氫酶等的活性，以研究飽和程度不同的油脂對微生物細胞活力影響的規律和機制，為反芻動物瘤胃微生態調控技術的研究和實際生產中油脂的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養管理

在揚州大學農牧場選擇3只1.5歲并裝有瘤胃瘺管的徐淮白山羊，平均體重為(29.7±0.14)kg，用于采集瘤胃液。試驗山羊分隔單舍，以玉米、豆粕和羊草為常規飼糧，于07:00和19:00分2次飼喂，自由飲水。

1.2 試驗設計與培養底物

試驗采用單因子試驗設計，共分5組，每組3重復。對照組不加油脂、試驗組分別為花生油組、菜籽油組、玉米油組和豆油組。底物組成與油脂碘價見表1，棕櫚酸鈣為本實驗室生產。

表1 底物組成與油脂碘價Table 1 Composition of substrates and iodine values of oil %

1.3 體外培養與取樣設計

參考Menke等［7］的方法。配制好培養液(人工唾液鹽∶瘤胃液 =2∶1)，通入 CO2，39℃水浴預熱。按照試驗設計準確稱取2.0 g底物置于培養瓶中，分別加入150 m L培養液。通入CO2，39℃恒溫水浴震蕩培養。

分別在培養后 0、4、8、12、16、24 h 取樣，每次取約15 m L培養液，分裝于3支離心管，其中1支立即離心并取上清液用于測定谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、乳酸脫氫酶的酶活;1支立即離心并用于測定總脫氫酶酶活;1只立即于-20℃冷凍保存，待分離微生物與微生物DNA的測定。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶及乳酸脫氫酶測定

各個時點取樣后立即7 000 r/mim離心15 min離心，并取上清液送江蘇省蘇北人民醫院，采用全生化分析儀測定。

1.4.2 總脫氫酶活性測定

參考Humeyan等［8］的方法，并略有改進。取100目尼龍布過濾的新鮮培養液2 m L于試管中，加入0.2 m L 1.5%的氯化三苯四氮唑(TTC)反應，而對照管先加入5 m L異丙醇抑制酶反應。在厭氧條件下恒溫水浴(38～39℃)10 m in。試驗組加入5 m L異丙醇終止反應后，以4 000 r/m im離心10 min。上清液稀釋15倍，于分光光度計在485 nm處比色。酶活單位定義為在38.5℃、pH 6.8條件下，每分鐘引起測定液吸光度上升0.1的酶量為1個酶活單位。

酶活單位(U/m L)=(樣品A485 nm/m in-對照A485 nm/m in)×15。

1.4.3 微生物分離與其DNA的測定

依據差速離心原理分離微生物，具體步驟為:1)原蟲:取瘤胃液加等體積生理鹽水置于恒溫(39℃)水浴鍋中震蕩(125 r/m in)水浴孵育60 m in，并輔以攪拌，再經4層紗布過濾，濾液離心(400 r/m im離心10 m in)，收集沉淀為原蟲，用生理鹽水洗滌2次后用生理鹽水懸浮，-20℃貯存待測。2)細菌:收集上述1)中離心后的上清液，再高速離心(15 000 r/m im離心15 m in)，收集沉淀為細菌，其余處理同1)中所述。

微生物DNA測定原理:微生物體內DNA所占比例比RNA或蛋白質等成分更為恒定，利用微生物的DNA量來代表微生物的總量更加科學。DNA二苯胺顯色后其595 nm處的吸光度與樣品中含量成線性關系，線性范圍為40～400μg/m L，據此將待測樣品釋至線性范圍內測定其光密度值、再據標準品測定得到的標準曲線即可查得樣品濃度。微生物DNA測定采用二苯胺顯色法并參照趙亞華［9］的步驟。制備小牛胸腺DNA鈉鹽(上海生工公司)標準溶液，制作以DNA量為橫坐標，吸光度值為縱坐標的標準曲線。以樣品的吸光度值從標準曲線上查出相對應DNA含量。

1.5 統計分析

Excel整理數據和作圖，用SPSS v16.0軟件中comparemean的One-way-ANOVA過程進行方差分析和Tukey多重比較。

2 結果與分析

2.1 轉氨酶及脫氫酶隨時間的動態變化

由表2和表3可見，培養液谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、乳酸脫氫酶等隨培養時間的延長大體上都不斷提高，其中以菜籽油組變化幅度最大、豆油組次之，并且該2組持續在遠高于對照組和其他油脂組的水平上變化;而玉米油組與花生油組與對照組接近，變化幅度不大。各個時間點比較，其中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶隨時間變化的幅度較大，同一組的隨時間變化有顯著變化(P＜0.05);而乳酸脫氫酶隨時間變化的幅度不大，同一組的各個時間點間沒有顯著差異(P＞0.05)。

由表3可見，隨著培養時間的延長，各組培養液總脫氫酶的活性有顯著增長的趨勢(P＜0.05)，除玉米組外，都以16 h的該酶活性最高，而后又略有下降。各組間變化不盡一致，其中以豆油組增長幅度最大，其次依次為玉米油組、花生油組、對照組和菜籽油組，總體看來僅菜籽油組的總脫氫酶活性在培養過程中持續低于對照組。

表2 培養液中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的活性變化Table 2 The activities of GOT and GPT in culture solution IU/L

表3 培養液中乳酸脫氫酶和總脫氫酶的活性變化Table 3 The activities of LDH and total dehydrogenase in culture solution

2.2 油脂對轉氨酶、脫氫酶均值的影響

由表4可見，各組間培養液乳酸脫氫酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶在各組間有顯著差異(P＜0.05)。3種酶都以菜籽油組最高、其次依次為豆油組、玉米油組、花生油組，除花生油組與對照組差異不顯著外(P＞0.05)，其他油脂組都顯著高于對照組(P＜0.05)。

總脫氫酶組間差異顯著(P＜0.05)。其中總脫氫酶以豆油組最高，顯著高于對照組(P＜0.05)、玉米油組次之、花生油組再次之，菜籽油組最低，在數值上低于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 油脂對培養液原蟲、細菌區系的影響

由表4還可知，培養液原蟲、細菌、微生物DNA，以及原蟲/細菌區系比例的均值與對照組差異不顯著(P＞0.05)，添加油脂的試驗組間也沒有顯著差異(P＞0.05);但本試驗中脫氫酶、轉氨酶等動態指標在時間點間基本均有顯著變化趨勢(表2、3)，而且同時進行的各時間點微生物DNA及原蟲/細菌區系比例測定也表明，各組的微生物DNA、原蟲/細菌比例(圖1、2)隨時間都有顯著或極顯著的變化(P＜0.05、P＜0.01)。這說明了微生物在培養過程中其區系、活力等都發生了變化，而要考察體系中微生物的客觀情況不僅要考察其均值或終點值，還要考察其動態指標;同時也表明，在本試驗的各組培養過程中微生物的量與活力雖然有較大的動態變化，但微生物的均產量受到的影響不大?？赏ㄟ^調節微生物的活力改變其發酵狀態，而不影響微生物蛋白產量。

3 討論

3.1 油脂對轉氨酶和乳酸脫氫酶活性的影響

谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和乳酸脫氫酶等一般在胞內的濃度遠遠高于胞外，但若細胞受損、胞膜破壞將導致胞外的濃度上升。在本研究中，各組培養液乳酸脫氫酶、谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶等隨時間培養時間的延長皆不斷提高，其原因可能即是在培養過程中隨時間的延長微生物與代謝物的積累而微生物細胞自溶導致細胞壁、細胞膜的破壞而釋放上述的酶所致［10-11］。其中以菜籽油組的變化幅度最大、豆油組次之，玉米油組與花生油組與對照組接近，變化幅度不大。可能是由于植物油脂的不飽和脂肪酸對原蟲或細菌具有一定的負效應，而且不飽和程度越高其負效應越大所致［2］。本試驗也表明碘價最高的豆油組其培養液轉氨酶、乳酸脫氫酶的活性較碘價較低的玉米油組、花生油組高，其微生物細胞的破損更為嚴重。

表4 4種油脂對培養液酶活及微生物區系的影響Table 4 Effects of the 4 kinds of oils on enzyme activity and m icroflora in culture solution

圖1 油脂對培養液微生物DNA的影響Fig.1 Effects of oils on m icrobial DNA in culture solution

圖2 油脂對培養液原蟲/細菌區系比例的影響Fig.2 Effects of oils on protozoa to bacteria ratio in calture solution

其中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶隨時間變化的幅度較大，同一組的各個時間點間有顯著變化;而乳酸脫氫酶隨時間變化的幅度不大，同一組的各個時間點間沒有顯著差異。其原因可能是谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶2種酶為微生物細胞生長繁殖中代謝過程中必不可少的“催化劑”，參與氨基酸的分解和合成［12］，在正常代謝時的細胞中含量較高。當微生物細胞有少量的破損時則培養液轉氨酶活性急速上升，臨床研究發現，有1%的肝細胞破損可使血清中轉氨酶增加1倍以上。而本試驗中該酶的酶活菜籽油組、豆油組、玉米油組等在24 h時已分別為對照組的10、6、3倍左右，說明添加油脂對微生物細胞的損傷程度增加，但具體的劑效關系有待進一步研究。相比之下，乳酸脫氫酶在各個時間點、或組間沒有顯著的變化，豆油組僅為對照組的1.2倍，遠遠小于2種轉氨酶的變化幅度，其原因可能是乳酸的代謝并非瘤胃微生物正常發酵的途徑，只有在大量淀粉或可溶性糖底物存在時才誘發牛鏈球菌的乳酸脫氫酶活性，以乳酸代謝為主［13-15］，因此，本體系中并未導致該酶類似轉氨酶的急劇升高。

3.2 油脂對總脫氫酶及其動態變化的影響

在瘤胃微生物中發現的總脫氫酶主要以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinam ide adenine dinucleotide，NAD+)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinam ide adenine dinucleotide phosphate，NADP+)為輔基的谷氨酸脫氫酶(GDH)和乳酸脫氫酶，其中NAD+-GDH很可能是微生物利用氨合成蛋白質最重要的酶。因此，總脫氫酶的活性能夠直接反映微生物發酵時脫氫酶傳遞氫的能力，即整體微生物的活力水平［16］。本研究發現隨著時間的延長，各組總脫氫酶的活性有顯著增長的趨勢，基本在16 h達到最高，之后又有所下降，這與微生物的生長繁殖規律相一致，即微生物的培養過程中指數生長期后會進入穩定期、衰亡期而使微生物活力下降所致［17-18］。

本試驗中豆油組和玉米油組總脫氫酶極顯著或顯著高于對照組，2個油脂試驗組間也有顯著差異，以豆油組顯著高于玉米油組。表明一定比例的不飽和油脂有一定的提高培養液微生物活性的效應。這可能是由于不飽和的油脂降解后其游離脂肪酸的不飽和鍵會抑制了原蟲［6］，使其群體生物量減少，進而減少其對細菌的吞噬，而增加細菌的數量，通過區系生物量的交替消長，而最終可能改變了微生物的生物總量及微生物總的活力所致［19-20］。

在本試驗添加4%水平油脂的基礎上，豆油組和玉米油組顯著高于對照組，表明不飽和程度更高的玉米油和豆油對通過限制原蟲而提高細菌具有積極的意義;但花生油組與對照組不顯著，表明其不飽和程度不高在4%的水平添加并未起到統計上的積極意義。而菜籽油組的總脫氫酶活性在培養過程中持續低于對照組，即該組對原蟲、細菌的負作用大于通過抑制原蟲提高細菌的正向作用，表明該添加水平致使微生物細胞的損害程度較大，其中可能也包括較大量的細菌細胞，而對瘤胃微生物的發酵起到了負面的抑制作用。由于本試驗實測了所使用的各油脂的碘價，表明菜籽油并非不飽和程度最高，但其負面效應最大的原因是否與菜籽油的芥酸［21］與培養液中氨的持續共存，再經由微生物復雜的作用，而形成有毒性的三聚氰酸、芥酸酰胺等物質有關，其具體原因有待進一步的研究。

由臨床研究可知，谷草轉氨酶/谷丙轉氨酶≥1時，常說明肝等組織細胞受到嚴重損傷。本研究該比值上小于1，而且表征微生物總活力的總脫氫酶活性除菜籽油組都高于對照組，因此推測認為，本研究添加4%的油脂的油脂除菜籽油外，尚未使微生物細胞有嚴重的損傷。

4 結論

在本試驗條件下，油脂對體外培養瘤胃微生物細胞活力有顯著的影響，其效應有隨著油脂不飽和程度的加大而加大的趨勢，其中以豆油的促進微生物活力效應最好，玉米油次之。

［1］DIJKSTRA J，GERRITS W J J，BANNINK A，et al.Modelling lipid metabolism in the rumen［C］//Modelling Nutrient Utilization in Farm Animals，MCNAMARA J P，FRANCE J，BEEVER D E，eds.Publisher:CABIPublishing，2000.

［2］MCGINN SM，BEAUCHEM IN K A，COATES T.Methane em issions from beef cattle:effects ofmonensin，sunflower oil，enzymes，yeast，and fumaric acid［J］.Journal of Animal Science，2004，82:3346-3356.

［3］王夢芝，程欣，謝文文，等.體外法研究不同油脂對瘤胃原蟲吞噬細菌微循環的影響［J］.中國農業科學，2010，43(8):3831-3837.

［4］BUSQUET M，CALSAM IGLIA S，FERRET A，et al.Effect of garlic oil and four of its compounds on rumen m icrobial fermentation［J］.Journal of Dairy Science，2005，88:4393-4404

［5］李旦，王加啟，卜登攀，等.運用Real-time PCR方法研究日糧添加豆油與胡麻油對肉牛瘤胃纖維分解菌數量的影響［J］.動物營養學報，2008，20(3):256-260.

［6］JALCˇD，CˇERTIK M，KUNDRIKOVA K，et al.Effect ofm icrobial oil and fish oil on rumen fermentation and metabolism of fatty acids in artificial rumen［J］.Czech Journal of Animal Science，2009，54(5):229-237.

［7］MENKE K H，STEINGASSH.Estimation of the energetic feed value obtained from chem ical analysis andin vitrogas production using rumen fluid［J］.Animal Research and Development，1988，28:7-55.

［8］HUMEYAN D B，NAGARAJA T G，M ILLER G W，et al.Rumen m icrobial changes in cattle fed diets with or without salinomycin［J］.Applied and Environmental Microbiology，1986，51(2):340-345.

［9］趙亞華.生物化學與分子生物學實驗技術教程［M］.北京:高等教育出版社，2005.

［10］JENKINS T C.Lipid metabolism in the rumen［J］.Journal of Dairy Science，1993，76:3851-3863.

［11］JALCˇD，KI?IDAYOVá S，NERUD F.Effect of plant oils and organic acids on rumen fermentationin vitro［J］.Folia Microbiologic，2002，47(2):171-177.

［12］加勒特，格里薩姆.生物化學［M］.3版.北京:高等教育出版社，2005:809-853.

［13］OWENS FN，SECRIST D S，HILLW J，etal.Acidosis in cattle:a review［J］.Journal of Animal Science，1998，76:275-286.

［14］ENEMARK JM，J?RGENSEN R J，ENEMARK P.Rumen acidosis with special emphasis on diagnostic aspects of subclinical rumen acidosis:a review［J］.Veterinary Zootechnique，2002，20(42):16-29.

［15］胡紅蓮，劉大程，盧德勛，等.日糧不同NFC/NDF比對奶山羊血液參數的影響［J］.江西農業大學學報，2008，30(5):855-859.

［16］劉春龍，李杰.絲蘭皂甙對綿羊瘤胃原蟲數目及酶活性的影響［J］.西南農業大學學報，2005，27(2):214-217.

［17］程茂基，盧德勛，王洪榮，等.不同來源肽對培養液中瘤胃細菌蛋白產量的影響［J］.畜牧獸醫學報，2004，35(1):1-5.

［18］李莉.應用微生物學［M］.武漢:武漢理工大學出版社，2006.

［19］NGUYEN T H N，NGUYEN T N，NGUYEN T，et al.Determ ination of the optimum level of a soybean oil drench with respect to the rumen ecosystem，feed intake and digestibility in cattle［J/OL］.Livestock Research for Rural Development，2007，19(8).［2011-02-01］.http://www.cipav.org.co/lrrd/lrrd19/8/nhan19117.htm.

［20］WANG M Z，WANG H R，YU L H.Effects of NDF content on protozoal community and grazing rate in rumen［J］.Journal of Animal and Veterinary Advances，2009，8(9):1746-1752.

［21］陳蛋，陳斌，陸道禮，等.近紅外光譜分析法測定菜籽油中芥酸的含量［J］.農業工程學報，2007，23(1):234-237.

*Corresponding author，lecturer，E-mail:mengzhiwang@yahoo.cn

(編輯 武海龍)

Effects of Different Plant Oils on the Enzyme Activity and Microbial Activityin vitro

WANG Shu1WANG Mengzhi1*LU Zhanjun2DONG Shuhong1ZHANG Xin1WANG Hongrong1
(1.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou225009，China;2.Gannan Normal College，Ganzhou341000，China)

The objectives of this paperwere to determ ine the effects of different plantoils on the enzyme activity and m icrobial activityin vitro.Three goats with permanent cannulas were used in a simple factor design.The control group was supplemented with no oil and the experimental groups were supplemented with peanut oil，rapeseed oil，corn oil，and soybean oil，respectively.The results showed that the activity of lactate dehydrogenase(LDH)，glutam ic oxaloacetic transam inase(GOT)，and glutam ic-pyruvic transam inase(GPT)were highest in rapeseed oil group and that in soybean oil group，corn oil group and peanut oil group fell in turn，the activity of LDH，GOT and GPT in the experimental groups were significant higher than that in the control group except for peanutoil group(P＜0.05)and therewere significantly differences among the experimental groups(P＜0.05).The activity of total dehydrogenase in soybean oil group was the highest and significantly higher than that of the control group(P＜0.05)and that in corn oil group，peanut oil group and rapeseed oil group fell in turn.Additionally，no significant difference was observed in the protozoal DNA，bacterial DNA，m icrobial DNA，and protozoa to bacteria ratio among groups(P＞0.05).However，m icrobial DNA was generally higher in soybean oil group and corn oil group at all sampling time points，and the changing trend along with time differed from each other.It was further observed that，protozoa to bacteria ratios weremuch lower in soybean and corn oil.In conclusion，different oils had different effects on m icroflora and activity of rum inalm icroorganismsin vitro，while soybean oil and corn oil showed much better effects on promoting m icrobial activity than the others.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(8):1309-1316］

oil;rumen m icrobe;transam inase;dehydrogenase;in vitro

S816.43

A

1006-267X(2011)08-1309-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.08.009

2011-02-25

國家自然科學基金(31072051);揚州大學創新培育基金(2010CXJ054)

王 曙(1987—)，男，江蘇宿遷人，碩士研究生，從事反芻動物瘤胃微生態營養調控的研究。E-mail:yzuwangshu@163.com

*通訊作者:王夢芝，博士，講師，E-mail:mengzhiwang@yahoo.cn