銅伴侶蛋白CCS介導銅鋅－超氧化物歧化酶激活的過程

唐 玲 馮 琳 劉 揚 胡 凱 周小秋，3*

(1.四川農業大學動物營養研究所，雅安 625014;2.魚類營養與安全生產四川省高校重點實驗室，雅安 625014;3.動物抗病營養教育部重點實驗室，雅安 625014)

銅伴侶蛋白CCS介導銅鋅－超氧化物歧化酶激活的過程

唐 玲1，2馮 琳1，2劉 揚1，2胡 凱1，2周小秋1，2，3*

(1.四川農業大學動物營養研究所，雅安 625014;2.魚類營養與安全生產四川省高校重點實驗室，雅安 625014;3.動物抗病營養教育部重點實驗室，雅安 625014)

CCS是細胞質中銅鋅－超氧化物歧化酶(SOD1)的銅伴侶蛋白。本文綜述了CCS介導SOD1激活的過程。CCS與SOD1通過蛋白－蛋白相互作用的方式將銅離子插入到不含銅離子的SOD1(apoSOD1)中，并促進二硫鍵的形成而激活SOD1。影響CCS活性的因素包括:X連鎖的細胞凋亡抑制蛋白(XIAP)、神經接頭蛋白X11α和銅代謝中含結構域Murr1蛋白(COMMD1)。

CCS;銅;SOD1

銅是具有氧化還原活性的動物必需的微量元素，它以酶的催化基團或結構輔因子的形式參與多種功能活動，如電子傳遞、氧合與催化等［1］。銅容易得失電子，即使在低濃度情況下也具有很強的毒性，因此動物機體銅的吸收、分配和排出都受到嚴格調控，以預防其積累所導致的大分子物質的氧化損傷［2］。銅離子在胞內的定位主要由3種銅伴侶蛋白實現:ATX1［3］、COX17［4］和 CCS［5］。CCS，即 copper chaperone for superoxide dismutase 1，Culotta等［5］首次在啤酒酵母菌株上用基因遺傳學方法將其鑒定出來。CCS與細胞質中的銅鋅－超氧化物歧化酶(SOD1)通過蛋白－蛋白相互作用的方式將銅離子插入到SOD1銅結合位點［5－7］。CCS 與 SOD1 活性有關［5，7－11］。本文就 CCS 介導的SOD1激活的過程作一綜述。

1 CCS的結構

CCS是由270～300個氨基酸組成的一條多肽，分子量大約是 28 ku［5，12］。這些氨基酸形成 3個結構域:CCS氮端即結構域Ⅰ，從 Met 1～Ser 80，包含2個α－螺旋片段與4股反向平行的β折疊，其中含有1個金屬結合序列(即 MHCXXC)，CCS結構域Ⅰ的組成與銅伴侶蛋白ATX1高度相似［13－15］;CCS的中間部分即結構域Ⅱ，從Leu 86～A la 234，包含8股希臘鑰匙β折疊桶結構，這是超氧化物歧化酶(SOD)家族的典型結構，并且其氨基酸序列與SOD亞基同源性高達47%，結構域Ⅱ包含了SOD1中所有結合鋅離子的His位點以及3個結合銅離子的His位點，SOD1中第4個結合銅離子的His位點在CCS中被 Asp取代［13－15］;CCS 的碳端即結構域Ⅲ，大約由40個氨基酸組成，碳端是無規則卷曲，該結構域氨基酸序列在各物種間高度保守，保守性達到90%，其中含有2個Cys殘基(即CXC)在所有物種上全部保守，也具有結合銅離子的能力［13，15］。人CCS在生理條件下以同源二聚體形式存在(圖1)。

2 CCS介導SOD1激活的過程

銅離子是SOD1活性中心的重要組成部分，SOD1催化超氧陰離子()歧化為氧氣(O2)和過氧化氫(H2O2)是由SOD1活性中心的銅離子通過得失電子實現［15－16］，而細胞中的銅離子均以螯合形式存在，幾乎沒有游離銅離子［17］，因此各種含銅蛋白中銅離子的獲取途徑是近年來研究的熱點。有關啤酒酵母的一系列遺傳學研究表明，銅離子在胞內的定位由銅伴侶蛋白家族介導［2－5］。CCS是銅伴侶蛋白家族中的一員，介導銅離子向SOD1定位［5］。在CCS基因缺陷型酵母中，SOD1的蛋白含量不受影響，但是該SOD1蛋白沒有活性［9］。CCS基因缺陷型小鼠胚胎成纖維細胞SOD1沒有活性是由于該蛋白不含銅離子［18］。而變性的不含銅離子的SOD1(apoSOD1)在CCS和銅鹽同時存在時有活性，僅有銅鹽時不具有活性［13］。Amy 等［18］在 CCS 基因缺陷型小鼠胚胎成纖維細胞中轉入CCS后，發現SOD1的活性得以恢復，并且該SOD1蛋白中銅離子含量也得以恢復。而銅離子進出細胞以及在胞內的定位是由親和力梯度驅動，SOD1對銅離子的親和力是CCS的10倍，因此銅離子從CCS傳遞到SOD1具有熱力學優勢［19］。這些研究表明CCS能夠介導SOD1中銅的定位以及SOD1的激活。

圖1 CCS形成的同源二聚體結構圖Fig.1 Homodimer structure of CCS［14］

CCS 的結構域Ⅰ分子量大約 8 ku［12］，它在CCS介導的SOD1激活過程中有重要作用。Schm idt等［7］用銅離子特異性螯合劑BCS(bathocuproine sulfonate)螯合細胞中游離銅離子，即模擬生理條件下無游離銅離子狀態，在CCS基因缺陷型酵母中轉入缺失結構域Ⅰ的CCS發現SOD1沒有活性。Amy等［18］在小鼠胚胎成纖維細胞中的研究得到相同的結果，并進一步分析發現該SOD1蛋白不含銅離子。這說明在銅離子極其有限的情況下，CCS的結構域Ⅰ是CCS激活SOD1必需的。而在生理條件下，銅離子均以螯合物的形式存在，細胞內幾乎沒有游離的銅離子［17］，因此CCS的結構域Ⅰ在生理條件下對SOD1激活有重要作用。研究發現CCS結構Ⅰ中金屬結合位點MXCXXC的2個Cys殘基參與結合銅離子［13］。銅離子結合后 CCS的穩定性增強［7，13］。酵母 CCS 結構域Ⅰ能夠與其結構域Ⅲ相識別和結合，并將銅離子轉移到結構域Ⅲ中的CXC位點［7］。因此生理條件下，CCS結構域Ⅰ在CCS激活SOD1中的必需性與其能夠從螯合劑中獲取銅離子并將銅離子轉移到CCS結構域Ⅲ中有關，結構域Ⅰ缺失后導致SOD1蛋白中不含銅離子而使SOD1沒有活性，因而CCS結構域Ⅰ的主要生理功能是從銅離子螯合劑獲取銅離子［13，17］。

CCS的結構域Ⅱ，分子量大約 16 ku［12］。雖然CCS結構域Ⅱ與SOD1同源性高，且含有SOD1中所有結合鋅離子的His位點以及3個結合銅離子的His位點，但是 CCS沒有SOD活性［7］。CCS結構域Ⅱ與SOD1一樣結合鋅離子，鋅離子的結合可能有利于其結構的穩定，這對CCS功能的發揮是必需的［20］，但是CCS結構域Ⅱ中潛在的銅離子結合位點卻不是CCS將銅離子傳遞給SOD1所必需的，因為將這3個His殘基定點突變為Gly之后，使銅離子不在該結構域結合，SOD1仍具有活性［13］。由于CCS與SOD1的序列同源性以及二聚體界面的相似性，CCS可能與SOD1通過結構域Ⅱ 相 互 識 別［6］。Hwanga 等［21］發 現 CCS 與SOD1在沙鼠椎體細胞中的分布完全一致。Falconi等［12］發現 CCS結構域Ⅱ與SOD1表面電荷分布相互匹配，并推斷CCS與SOD1可能通過這種電荷互補性相識別和結合。酵母CCS能與SOD1相識別和結合，并且這種結合需要CCS的結構域Ⅱ和Ⅲ［6］。Lamb 等［14］研究發現 His 48 定點突變成Phe的SOD1不能結合銅離子，突變的SOD1與CCS形成了異源二聚體(圖2)，二聚體界面有4個氫鍵:SOD1中Gly 52和Gly 115與CCS中217 Arg，CCS中Arg 187和Gly 137與SOD1中Leu 152分別形成2個氫鍵。而將酵母CCS結構域Ⅱ形成二聚體界面Phe 136和Gly 137突變為Glu 以后，酵母體內的 SOD1 則沒有活性［8，18］，這種SOD1不含有銅離子［18］。因此CCS的結構域Ⅱ與SOD1相互識別和結合，結構域Ⅱ中的潛在銅離子結合位點與SOD1激活無關，但是該結構域中形成二聚體界面的氨基酸殘基突變后導致CCS無法與SOD1識別而使銅離子不能插入到SOD1 中，進而導致 SOD1 沒有活性［8，18］。

圖2 CCS與SOD1形成的異源二聚體Fig.2 Heterodimer structure of the complex between CCS and SOD1［14］

CCS的結構域Ⅲ是由30～40個氨基酸組成的多肽，是一段無規則卷曲［7，12］。在所有物種中，CCS結構域Ⅲ中CXC序列高度保守，CCS結構域Ⅲ對于SOD1的活性至關重要［7］。在CCS基因缺陷型酵母中轉入缺失結構域Ⅲ的CCS或者轉入結構域Ⅲ中Cys定點突變的CCS，SOD1均沒有活性［7，8］。酵母 SOD1完全不能與缺失結構域Ⅲ的CCS相結合，但是SOD1與Cys定點突變的CCS相結合的量不受影響［8］。這表明結構域Ⅲ是CCS與SOD1相識別與結合必需的，Cys雖與識別過程無關但卻是銅離子插入SOD1必需的。轉入結構域Ⅲ中 Cys定點突變的 CCS后，SOD1沒有活性［8，18］，該 SOD1 蛋白不含銅離子［18］。結構域Ⅲ與結構域Ⅰ相識別并結合銅離子［7］。Lamb等［14］發現CCS的結構域Ⅲ延伸到SOD1的銅結合位點，并且CCS中Cys 229與SOD1中Cys 57形成二硫鍵。因此，CCS結構域Ⅲ從結構域Ⅰ中獲取銅離子后延伸到SOD1的銅結合位點，并將銅離子插入到SOD1的銅結合位點，是激活SOD1必需的［8，14，18］。

CCS介導SOD1激活過程一般包括2步，第1步是CCS介導銅離子插入到SOD1中，第2步是SOD1二硫鍵的形成［15］。SOD1是同源二聚體，各亞基都有一個保守的二硫鍵，這與SOD1結構穩定以及活性中心形成有關，將SOD1中Cys 57或Cys 146定點突變使其不能形成二硫鍵時，雖然其中的銅和鋅的含量不受影響，但SOD1蛋白沒有活性［10］。酵母和大腸桿菌CCS激活SOD1需要氧的參與［9－10］。在厭氧條件下，CCS與 SOD1不能相識別和結合［22］。Furukawa 等［10］研究報道，僅有CCS和CuSO4處理時幾乎檢測不到二硫鍵，而在氧、CCS和CuSO4同時處理時檢測到大量二硫鍵，表明氧能夠誘導二硫鍵的形成。結合Cu+的人CCS與變性SOD1在有氧條件下孵育，Cu+被快速氧化為Cu2+，而在厭氧情況下孵育Cu+沒有被氧化［9］。Cu2+能夠氧化 Cys形成二硫鍵［23］。CCS中Cys 229與SOD1中Cys 57形成分子間二硫鍵［14］。而CCS能夠促進氧誘導的分子間二硫鍵的異構化形成SOD1分子內二硫鍵［10］。

綜上所述，在生理條件下，CCS的結構域Ⅰ從螯合劑中獲取銅離子并結合到其金屬結合框CXXC中，結構域Ⅱ則與apoSOD1相互識別而形成異源二聚體，結構域Ⅲ與結構域Ⅰ相互作用使銅離子轉移到結構域Ⅲ中金屬結合位點CXC上并延伸到SOD1的銅結合位點，在氧的作用下氧化Cu+為Cu2+，Cu2+使CCS中Cys 229與SOD1中Cys 57氧化形成二硫鍵，同時釋放銅離子到SOD1銅結合位點，CCS促進該分子間二硫鍵異構化而形成SOD1分子內二硫鍵。此時，異源二聚體分開，各自形成同源二聚體，SOD1被激活。

3 影響CCS活性的因素

目前研究發現，有3種蛋白能夠影響CCS活性:X連鎖的細胞凋亡抑制蛋白(XIAP)、神經接頭蛋白X11α和銅代謝中含結構域Murr1蛋白(COMMD1)。

XIAP能提高 CCS活性。Brady等［11］研究發現，XIAP基因敲除或小干擾RNA(siRNA)干擾其在酵母和小鼠胚胎成纖維細胞表達后，SOD1活性降低。生理條件下CCS結構域Ⅱ能與XIAP相互識別和結合并且XIAP誘導CCS中Lys 241不依賴于蛋白體的泛素化，提高CCS作為SOD1銅伴侶蛋白的活性。而銅濃度較高時，CCS介導銅離子傳遞給XIAP，使CCS結構域Ⅲ中的 Cys泛素化，從而進入 26S 蛋白體途徑降解［11，18，24］。

X11α 抑制 SOD1 活性。M cLoughlin等［25］在鼠卵巢細胞上的研究表明，CCS與X11α分布相同，且X11α的PDZ 2結構域與CCS結構域Ⅲ結合。因此X11α對SOD1活性的抑制作用是由于其與CCS結構域Ⅲ結合，導致CCS不能將銅離子插入到SOD1中所致。

COMMD1也能抑制 SOD1活性。W illianne等［26］在人胚腎細胞的研究中發現，COMMD1過量表達影響SOD1二聚體的含量而使SOD1活性降低，而siRNA干擾其表達后，SOD1活性升高。因此，COMMD1通過抑制 SOD1二聚化而降低SOD1活性。

4小結

銅是動物必需的微量元素之一，也是SOD1活性中心的重要組成部分，SOD1的激活主要由CCS介導。研究CCS介導SOD1激活的過程，一方面有助于完善銅離子在細胞內定位和SOD1激活的理論知識，另一方面也為營養物質對機體抗氧化防御的影響方式提供研究方向和依據。關于CCS激活SOD1的研究還存在以下問題:1)銅離子從CCS結構域Ⅰ到結構域Ⅲ以及SOD1銅結合位點中，CCS和SOD1具體構象改變有待研究;2)CCS和SOD1中具體哪些氨基酸殘基參與銅離子的轉運有待深入研究。

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*Corresponding author，professor，E-mail:zhouxq@sicau.edu.cn

(編輯 田艷明)

Activation Process of Copper/Zinc Superoxide Dismutase Mediated by CCS

TANG Ling1，2FENG Lin1，2LIU Yang1，2HU Kai1，2ZHOU Xiaoqiu1，2，3*
(1.Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Ya’an625014，China;2.Fish Nutrition and Safety Production University Key Laboratary of Sichuan Province，Sichuan Agricultural University，Ya’an625014，China;3.Key Laboratory for Animal Disease-resistance Nutrition of China Ministry of Education，Sichuan Agricultural University，Ya’an625014，China)

CCS is the copper chaperone for copper/zinc-superoxide dismutase 1(SOD1)in cytoplasm.This review described the activation process of cytosolic SOD1 mediated by CCS.With the protein-protein interaction of CCS and SOD1，CCS can directly insert the copper ion into apoSOD1 and promote the formation of intramolecular disulfide bond in SOD1，then finish the activation of SOD1.The activity of CCS can be affected by X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP)，neuronal adaptor protein X11α and copper metabolism(Murr1)domain containing 1(COMMD1).［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(8):1259-1263］

CCS;copper;SOD1

S852.2

A

1006-267X(2011)08-1259-05

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.08.001

2011－03－03

國家公益性行業(農業)科研專項(201003020)

唐 玲(1986—)，女，重慶墊江人，碩士研究生，從事水生動物營養研究。E-mail:mm tanglingyy@163.com

*通訊作者:周小秋，教授，博士生導師，E-mail:zhouxq@sicau.edu.cn