越桔組織培養的相關研究

張在盛，王秀華

(東北林業大學生命科學學院，哈爾濱150040)

1 越桔相關情況簡介

越桔 (Vaccinium vitis－idaeaL.)，杜鵑花科，越桔屬。常綠矮生灌木，地下莖長，匍匐，地上莖高10cm左右，直立，有白微柔毛［1］，果實為直徑1～2cm的紅色漿果。主要分布于北歐、北美以及我國的長白山和大小興安嶺地區［2］，這些地區屬于高寒地區，不適于大多數植物的生長，但由于越桔具有極強的抗寒及環境適應能力，很多處于北方寒冷地區的國家把其作為較重要的果樹種類引進種植，最為重要的就是越桔自身具有極高的食用和藥用價值，因此被廣泛關注。

1.1 越桔的食用價值

越桔果實可被加工成果醬、果干，還可以作為輔料加工奶制產品，味道極佳，深受廣大群眾的喜愛。其果實含有大量有機酸，還含有多種糖類，維生素和微量元素，具有極高的營養價值［3］，同時，越桔果實中含有大量的色素，可以作為優良的天然色素食用。

1.2 越桔的藥用價值

越桔可以以葉入藥，性溫，味苦，具有解毒、利尿、消炎等諸多功效。可以用于治療風濕、痛風等疾病。越橘果實含有多種藥用成分，包括:抗氧化物，蹂酸，葉酸，抗菌成分。其中花青素、SOD的含量超過其它植物許多倍，花青素對治療胃潰瘍、抗血凝、改善夜視力等方面具有顯著效果。豐富的SOD在預防癌癥和心臟病方面也具有重要的作用。同時，在越桔的果實和莖葉中含有黃酮、萜類等多種活性成分［4］，可以避免血管變脆變薄，有效地保護血管，改善人體微循環。在防輻射，防衰老，抗腫瘤等方面也已進入臨床。因此，越桔在國外早已成為關注的熱點，稱為眾多學者爭相研究的對象，其中越桔的組織培養就成為了其中極為重要的一個組成部分。

2 越桔的組織培養

2.1 材料的選取與處理

2 .1 .1 材料的選取

越桔組織培養的選材非常重要，也可謂是各有千秋，一般分為兩種途徑，一種是直接取自野生的越桔植株的一部分作為外植體，例如金彥磊［5］等在越桔離體培養的組織學研究中選取大興安嶺野生的越桔葉片作為外植體接種于含有TDZ的WPM培養基中進行離體培養［5］。顧地周［6］等取長白山北坡的針闊葉混交林中的篤斯越桔休眠枝條利用水培法促使腋芽萌發做為外植體。另外一種是利用種子萌發［5］，然后取萌發后幼苗的不同部分作為外植體，例如利用幼苗的子葉和胚軸等，這樣做的好處是避免了外植體染菌的幾率，同時也能較快速的得到所需的外植體，避免了采摘外植體所受地域和時間的限制。

2 .1 .2 材料的采摘與處理

如果選擇采摘野生越桔作為外植體，那么要盡量選擇植株長勢旺盛且氣溫較涼爽的季節，因為此時植株在培養過程中容易成活而且不易染菌，但是氣溫亦不宜過低，否則植株體已近休眠，培養過程中成芽率低。然后對外植體進行有效地清洗以及消毒處理，用蒸餾水清洗去除外植體表面的污物，將其置于消毒液 (新潔爾滅等)中浸潤30～45min，取出后用無菌水沖洗6～7次，洗凈備用。在這一過程中可以加70%的酒精以及氯化汞加以浸泡，再用無菌水清洗數遍備用，以達到更好的消毒效果［7］。其中在氯化汞中浸泡的時間應控制在8～9min為宜，少則易造成消毒不充分致外植體染菌，多則可能造成外植體不同程度的黃化和褐化［8－9］。

2.2 越桔組織培養中的影響因素

2 .2 .1 培養基的篩選

眾所周知，植物組織培養的培養基的選擇非常重要。經過眾多實驗對比發現，WPM培養基最為適合越桔的組織培養，高鹽濃度的MS對越桔的生長有抑制作用。因此大部分人都以WPM培養基作為越桔組培的基礎培養基或加以改良，和加衛等用水合硝酸鈣水合硝酸鈣 ［Ca(NO3)2·4H2O］684 mg/L、KNO3190 mg/L、C10H13FeN2NaO874.3 mg/L和鹽酸硫胺素0.1代替原WPM培養基中的K2SO4、CaCl2、FeSO4和乙二胺四乙酸鈉(Na2EDTA)［10］，林寶山等將 KH2PO4含量減少1/2，CaNO3為原來的1倍，NaCl為原來的2倍。結果證明，改良過的WPM培養基在對不同越桔品種的誘導分化以及增殖具有獨特的效果。

2 .2 .2 溫度、光照的影響

研究表明，適合越桔生長的溫度在15～28℃之間，最適溫度為20℃，溫度低于10℃或高于30℃將造成光飽和點迅速下降，抑制其光合作用，因此，20℃左右的溫度為最適培養溫度［11］。另外，通常選擇1 500～2 000 lx的光強以及配合8～10h的暗處理對越桔組織的初始誘導有著非常良好的效果。

2 .2 .3 蔗糖濃度的影響

為了研究蔗糖濃度對越桔組織培養的影響，Debnath分別在培養基中加入了10、20和30g/L的蔗糖，結果發現20g/L的蔗糖對越桔的生長最為有效［12］，同樣的結果和發現也在其他研究中 (如Qu et al.，2000)有記載，因此，現在越桔組織培養中通常都在培養基中添加20g/L的蔗糖以促進再生苗的生長。

2 .2 .4 激素的影響

激素在植物組織培養中的重要性毋庸置疑，因此正確的選擇合適的激素以及激素的使用量非常關鍵。經 Julia Meiners［13］以及段祖安［14］等人實驗證明，Zeatin在對越桔苗的初始誘導以及后續的增殖培養有著突出的效果，相反，2－ip的誘導效果則相當不明顯，不但出芽率低，而且幼苗的長勢也不如加入zeatin的培養基中幼苗長勢旺盛，還會出現葉片變紅的跡象。另外，少量的TDZ也可促進越桔苗的生長，但濃度不宜過高，5mg/L最佳［12］，多則反而抑制芽苗的生長，TDZ在很多組織培養中都有使用，如一些木本植物的組織培養 (Huetteman and Preece，1993)以及一些其他越桔品種如兔眼越桔 (Marcotrigiano et al，1996)的組織培養中都扮演著重要的角色，說明其具有很強的誘導植物生長的作用。研究中還發現，肌醇對于越桔組織培養也有著很好的效果，林寶山等在培養基中加入少量肌醇就起到了很好的效果，同樣的結果在Julia Meiners關于越桔的組織培養一文中也有相關的記載。其他激素如NAA、6－BA等雖有促進植物生長的作用，但針對于越桔效果卻不理想。

2 .2 .5 pH的選擇

越桔喜生于有機質豐富的土壤上，pH值大約在4～6之間［15］，為了模擬這一生態環境，一般研究者都選擇pH在5～6之間的培養基，事實證明，這種微酸性的培養基對于越桔幼苗的生長非常有利，幼苗生長旺盛，側枝條數較多且存活率高。

2.3 越桔組織培養的生根問題

2 .3 .1 試管內生根

國內主要將長勢良好的幼苗移至生根培養基中，在試管內進行生根培養，通常選取的是WPM基礎培養基，加入利于生根的各類激素，實踐證明IBA相對于其他激素適合大部分品種的越桔苗的試管內生根，生根率較高。然后經過煉苗以后就可以進行移栽了。煉苗過程中需注意補水，防止小苗因為缺水而枯萎。

2 .3 .2 試管外生根

但經眾多研究證明，越桔組織培養中在試管內完成生根非常困難，即使可以生根，根的條數也很少而且長勢也不旺盛，移栽存活率很低。因此，試管外生根技術就被廣泛應用于越桔的生根培養。管外生根將試管苗的生根階段中的生根和馴化結合起來，不但減少了試管內生根易染菌的弊病，而且簡化了組織培養的程序，降低成本的同時又提高了繁殖系數［16－20］，可以說為那些在試管內生根困難的組培品種解決了難題。國內外管外生根大多采用微體扦插法進行，研究者發現，將無根幼苗切下以后采用0.8%的IBA速蘸處理，然后將其置于泥炭∶珍珠巖=2∶1的生根基質上，放于噴霧箱中保濕處理，生根率可以達到80% ～90%［12］，而且植物的根系長勢旺盛，可以進行大規模的種植。

3 討論

近年來，隨著人們的保健意識的增強，對保健食品的關注度也就越來越高。因此，越桔由于其顯著的食用以及藥用保健價值也就得到了更加廣泛的關注和研究空間，越來越多的人開始研究越桔。而越桔的組織培養不但可以使其迅速繁殖，進入產業化種植并且實現其巨大的經濟價值，還能為其他研究提供無菌材料。因此，針對于越桔組織培養的相關研究就顯得尤其重要。綜上所述，就是作者針對國內外有關越桔組織培養中的關鍵環節的一些總結。本文作者從外植體的選擇和消毒，最適培養基以及最適激素的選擇，溫度、pH值以及生根問題等諸多因素進行篩選和討論，目的就是將最優的選擇提煉出來，為其他關于越桔組織培養的相關研究提供一個快捷的平臺和理論實踐依據，為越桔的深入研究貢獻一份力量。

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