子癇前期患者血清sHLA-G與外周血NK細胞的相關性研究

孫 煒，孫 炯

(1鹽城衛生職業技術學院，江蘇鹽城224006;2鹽城市亭湖區人民醫院)

子癇前期是妊娠期特有的疾病，是嚴重威脅母嬰安全的產科并發癥，其發病機理至今尚未完全闡明［1］。研究表明人類白細胞抗原 G(HLA-G)在重度子癇前期患者胎盤組織中表達低下，揭示HLA-G在妊娠期高血壓疾病中可能起著非常重要的作用［2，3］，子癇前期患者胎盤組織 HLA-G 表達缺陷可導致自然殺傷細胞(NK細胞)功能異常，從而影響母胎免疫耐受［4］。2008年7月～2010年3月，我們通過測定血清中可溶性HLA-G(sHLA-G)以及外周血NK細胞的表達及相關性分析，探討sHLA-G在子癇前期發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 我院分娩產婦121例，其中輕度子癇前期患者45例(實驗A組)，重度子癇前期患者34例(實驗B組)，正常妊娠婦女42例(對照組)。重度子癇前期及輕度子癇前期的診斷符合臨床標準［5］。各組孕婦的年齡及孕周比較差異無統計學意義(P＞0.05)。各組孕婦均無肝炎、結核等急、慢性傳染病史，無高血壓、心臟病、免疫治療史，胎兒性別及體質量、胎盤重量差異無顯著性。

1.2 血清sHLA-G水平測定 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)雙抗體夾心法檢測。正常妊娠孕婦分別于建卡時、中孕、臨產前抽取肘靜脈血3 ml，子癇前期患者于臨產前采集肘靜脈血3 ml。所有血標本放置在4℃冰箱，靜置4 h，待自凝后5 000 r/min離心10 min，分離血清，置于 －80℃冰箱凍存備用。ELISA試劑盒購自Biovendor公司，所有操作嚴格按試劑盒說明書進行。用Bio-Tek EL×800酶標儀于450 nm波長測定各樣本吸光值。以標準品已知濃度的對數及光吸收值分別為X軸和Y軸，形成標準曲線，用Curve Expert軟件處理數據產生半對數圖，依據各待測樣品測得的吸光值計算其sHLA-G水平。

1.3 外周血NK細胞數量檢測 以免疫組化SP法測定。淋巴細胞分離液購自中國醫學科學院，NK細胞檢測試劑盒(包括鼠抗人CD16、CD57單克隆抗體、生物素偶聯的兔抗鼠IgG抗體、鏈霉親和素-HRP、過氧化物酶底物)購自北京元康醫學技術公司。無菌取受試者空腹外周靜脈血各2 ml，肝素抗凝，按常規方法分離出外周血單個核細胞(PBMC)后，嚴格按試劑盒說明進行操作，并按標準判定NK細胞百分比。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行統計。各組數據以±s表示，結果采用單因素的方差分析(組間比較采用LSD法)，以及Pearson相關分析。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 血清中sHLA-G表達比較 對照組早孕期、中孕期、晚孕期分別為(14.02 ±5.31)、(13.64 ±5.09)、(12.58 ±4.66)ng/ml，F=6.578，P ＞ 0.05。對照組晚孕期、實驗A組和實驗B組分別為(12.58±4.66)、(10.74 ±3.21)、(9.06 ±2.66)ng/ml，F=8.776，P=0.001;組間兩兩比較，P 均 ＜0.05。

2.2 外周血NK細胞百分比比較 實驗A組、實驗B組及對照組晚孕期分別為(16.14±2.93)%、(18.55 ±3.15)%及(13.15 ±2.60)%，F=33.361，P=0.001;組間兩兩比較，實驗A、B組均高于對照組(P=0.001)。

2.3 相關性分析 子癇前期患者外周血NK細胞百分比和血清sHLA-G存在負線性相關關系，(r=－0.401，P=0.001)。

3 討論

HLA-G主要在人的胎盤組織中表達，定位于母胎界面絨毛外滋養細胞上［6］，在羊水、臍帶血以及母體血循環中也有一定量的表達。HLA-G的正常表達對孕卵的著床及維持起著重要作用，子癇前期患者及不明原因的習慣性流產患者胎盤、血清中HLA-G表達下降，使滋養細胞侵蝕分化過程下降，滋養細胞不易侵入子宮蛻膜及重鑄螺旋動脈，絨毛著床過淺、血管發育欠佳，不能有效供應胎盤營養，且滋養細胞易受母體免疫系統的攻擊，使胎盤生長發育受限，可導致子癇前期、流產等［7，8］。絨毛外滋養細胞是與母體組織直接接觸的胚胎細胞，其細胞表面所表達的HLA-G可通過與NK細胞表面抑制性受體結合，抑制NK細胞的胞毒活性，從而維持母胎免疫耐受［9］。

外周血sHLA-G可以反映體內HLA-G表達水平，sHLA-G不僅可在母胎界面致免疫耐受，并影響整個免疫系統的作用。本研究結果顯示，子癇前期組與正常妊娠組間sHLA-G的表達存在顯著差異，重度子癇前期組亦低于輕度子癇前期組，說明sHLA-G分子的低表達與子癇前期發病密切相關，并可能促進子癇前期的病程發展，sHLA-G分子的表達與子癇前期病情的輕重呈負相關。通過對外周血NK細胞數量比較，子癇前期患者外周血NK細胞百分比均顯著高于正常孕婦，且隨血清sHLA-G的下降而呈升高趨勢。子癇前期患者滋養細胞HLA-G存在轉錄及蛋白水平缺陷，可能由此而引發NK細胞對滋養細胞的殺傷作用［10］。

迄今為止，母胎界面的免疫調控機制尚未被系統性地闡明，HLA-G在母胎界面發揮了重要的免疫作用，進行這一方面的研究，對異常妊娠及移植免疫分子機制的認識有著重要的意義。在此基礎上，進一步擴大樣本量，并與臨床分型綜合分析，可為臨床診斷與治療提供理論基礎。

［1］侯彩英，閔保華，蔡穎，等.sHLA-G在子癇前期患者的表達及意義［J］.現代生物醫學進展，2008，8(10):1905-1906.

［2］朱曉明，楊瑛，姚元慶.HLA-G亞型蛋白在正常妊娠及重度子癇前期患者胎盤中的表達差異［J］.實用醫學雜志，2006，22(4):388-390.

［3］孫新六，劉秀蘭.HLA-G檢測及先兆子癇產前預診指標建立［J］.臨床檢驗雜志，2006(4):267-269.

［4］張展，賈莉婷，常彩紅.先兆子癇患者母、臍血NK細胞增殖能力及殺傷功能測定［J］.鄭州大學學報，2005，40(4):688-691.

［5］樂杰.婦產科學［M］.6 版.北京:人民衛生出版社，2004:99.

［6］Pace JL，Morales PJ，Phillips TA.Analysis of the soluble isoforms of HLA-GmRNAs and proteins［J］.Methods Mol Med，2006，122(1):181-203.

［7］Hunt JS，PetroffMG，McIntire RH，etal.HLA-G and immune tolerance in pregnancy［J］.FASEB J，2005，19(7):681-693.

［8］楊勉，趙亞麗，郝冬梅.HLA-G在妊娠中的研究進展［J］.中國優生與遺傳雜志，2009，17(1):113-115.

［9］韓子英，王利，馬寶驪，等.HLA-G分子在體外抑制NK細胞殺傷效應的研究［J］.上海免疫學雜志，2001，21(4):221.

［10］Goldman-Wohl DS，Ariel I，Greenfield C，et al.Lack of human leukocyte antigen-G expression in extravillous trophoblasts is associated with pre-eclampsia［J］.Mol Hum Reprod，2000，6(1):88-95.