亮氨酸對肉雞腸上皮細胞TOR基因表達調(diào)控的研究

王瑞賀 李然 韓靜婭 史衛(wèi)平 丁顯濤 劉寧

河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471003

雷帕霉素靶蛋白(Target of Rapamycin，TOR)是一類進化上十分保守的Ser/Thr蛋白激酶，屬于磷酸肌醇相關激酶家族成員，廣泛存在于各種生物細胞中。TOR也是一種重要的信號分子，在調(diào)節(jié)細胞生長和細胞周期中起到中樞作用。它能夠激活下游信號傳導通路，通過4E-BP1、S6K等翻譯調(diào)節(jié)因子的磷酸化作用來傳遞外界營養(yǎng)狀況、生長因子等信號，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)核糖體的發(fā)生、蛋白質(zhì)的合成等生理過程，進而綜合調(diào)控細胞的生長、增殖、凋亡和自噬。TOR信號是營養(yǎng)、化學和運動等因素導致細胞生長和分化的一個關鍵信號，生長因子、營養(yǎng)素、能量、應激以及雷帕霉素(Rapamycin)等因素可以調(diào)控TOR信號活性。

氨基酸通過TOR信號調(diào)控蛋白質(zhì)合成和細胞生長，是最重要的功能性營養(yǎng)素，尤其亮氨酸(Leu)在蛋白翻譯起始和刺激蛋白質(zhì)的合成中起著獨特的作用，可激活新生動物骨骼肌TOR，但其對蛋白質(zhì)合成的激活作用還依賴于其它氨基酸的有效性。腸上皮細胞(Intestina1 Epithe1ia1 Ce11，IEC)在營養(yǎng)素吸收、轉運以及營養(yǎng)與生長信號整合方面發(fā)揮著重要作用，而關于Leu對IEC中TOR信號活性的影響缺乏報道。本文旨在研究不同濃度亮氨酸對體外培養(yǎng)的肉雞IEC中TOR信號mRNA表達的影響，為探討氨基酸調(diào)控蛋白質(zhì)合成的作用機制及建立精確的營養(yǎng)供給技術提供理論基礎和開創(chuàng)性思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DMEM培養(yǎng)基、TRIZOL試劑購自Gibco(美國)；胰蛋白酶、EDTA、亮氨酸購自 Sigma(美國)；同胎牛血清(FBS)購自 At1anta Bio1ogica1s(美國)；RT-PCR試劑盒購自Fermentas，其余試劑均為分析純。CO2培養(yǎng)箱購自上海一恒公司 (BPN-150CRH 中國)，PCR儀Techne(TC-412 英國)。

1.2 細胞分離與培養(yǎng)

選用發(fā)育正常的18日齡AA肉雞胚胎20枚，對照組和實驗各組分別包括5枚雞胚，無菌摘取腸道組織，分別分離并鑒定IEC。IEC細胞在37℃、10%CO2、90%O2、90%相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM，給予10%小牛血清，100U/m1青霉素，100U/m1鏈霉素。對照組不含 Leu(0mM)、 實驗 I、II、III和 IV 組分別含 Leu 50mM、100mM、150mM和200mM。原代IEC細胞與對照組和各實驗組在37℃條件下共孵育2h(n=5)后，收集細胞。

1.3 RT-PCR擴增

對收集的細胞進行總RNA抽提，并紫外分析檢測所抽提RNA的純度。根據(jù)Genbank登錄的雞TOR基因和雞β-actin基因為模板，采用Primer prem ier軟件設計引物 (表1)。采用兩步法RTPCR：(1)逆轉錄反應獲得細胞cDNA；(2)PCR反應，采用內(nèi)對照β-actin和目的基因TOR特異性引物，以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，照相。以β-actin為內(nèi)參，對各組基因擴增產(chǎn)物的電泳條帶進行光密度掃描。

表1 基因擴增的引物信息

1.4 統(tǒng)計分析

定量數(shù)據(jù)為TOR基因與β-actin基因表達量的比值，以均數(shù)±標準差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩組間多重比較采用鄧肯氏檢驗。采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析。以P﹤0.05為差異具有顯著性。

2 結果

用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，電泳圖條帶清晰，實驗II組(Leu，100mM)和III組亮度高，實驗 I組(Leu，50mM)和 IV 組(Leu，200mM)條帶亮度較低，對照組條帶幾乎看不到，表明實驗II組和III組雞胚IEC中TOR基因mRNA表達豐度較高，而實驗I組和IV組表達量較低。

根據(jù)雞TOR基因mRNA擴增產(chǎn)物電泳帶的光密度和內(nèi)標基因β-actin光密度的比值，得到TOR基因mRNA表達的相對量，見圖2。實驗組Leu表達量相對比值均顯著高于對照組(P﹤0.05)。4個實驗組中，II組和III組顯著高于I組和IV組(P﹤0.05)，但II和III組之間差異不顯著 (P≥0.05)。說明Leu能顯著提高雞IEC中TOR基因表達，以100mM和150mM效果最好。

圖2 Leu對雞胚IEC中TOR與β-actin基因比值的影響，實驗I-IV組Leu濃度分別為50mM、100mM、150mM、200mM

3 討論

動物對生長信號和營養(yǎng)感應是通過一系列信號途徑來整合的，其中TOR信號是最重要的細胞信號，該信號是在轉錄和翻譯水平調(diào)節(jié)細胞生長和蛋白合成的中樞。TOR根據(jù)細胞環(huán)境的營養(yǎng)條件做出相應的應答，參與調(diào)控蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的活性，從而控制與蛋白質(zhì)合成和基因轉錄相關基因的表達。外界營養(yǎng)條件如碳源和氮源能刺激細胞的生長。在TOR作用條件下，當營養(yǎng)物質(zhì)或其他的生長刺激出現(xiàn)時，細胞主動上調(diào)大分子物質(zhì)的合成，促進細胞生長；相反地，為適應營養(yǎng)限制或其他應激，細胞能夠抑制大分子物質(zhì)的合成和提高物質(zhì)周轉量。

營養(yǎng)因素對TOR活性具有顯著的上調(diào)作用，而抗營養(yǎng)因子對其具有下調(diào)作用。Du et a1.(2005)發(fā)現(xiàn)對奶牛限飼降低了骨骼肌細胞中TOR信號活性。Liu et a1.(2008)報道植酸顯著下調(diào)了TOR在肉雞小腸中的mRNA表達，表明植酸降低了細胞的營養(yǎng)信號、蛋白合成以及細胞生長。Leu在蛋白翻譯起始和刺激蛋白質(zhì)的合成中發(fā)揮著重要作用。W i1son等(2010)研究表明長期靜脈注射Leu激活了新生動物骨骼肌TOR，但其對蛋白質(zhì)合成的激活作用還依賴于氨基酸的有效性。

IEC起源于腸上皮干細胞的分化，腸上皮干細胞位于陷窩基底部，是一類具有自我更新、高度增殖、不對稱性分裂和多向分化潛能的細胞。IEC是腸道內(nèi)主要的功能細胞，參與腸道食物的消化、吸收及內(nèi)外分泌，構成體內(nèi)的免疫屏障，調(diào)控體內(nèi)免疫水平，并阻止微生物及毒素對腸道的侵襲。因此，促進IEC的分裂增殖，在維持腸道粘膜正常結構、功能和代謝等方面具有重要的作用。但是，關于營養(yǎng)介導的IEC中TOR信號活性的研究尚無報道。本研究中，Leu顯著提高了TOR基因在體外培養(yǎng)IEC中的表達，表明Leu促進了IEC的分裂增殖，并且培養(yǎng)液中Leu的最佳濃度為100～150mM。但是，由于體內(nèi)環(huán)境的復雜性，該濃度范圍在體內(nèi)研究中是否具有類似效果，值得進一步研究。另外，Leu與腸道的功能物質(zhì)谷氨酰胺和以小腸為主要代謝場所的精氨酸之間是否具有互作效應也值得進一步研究。

4 結論

Leu具有顯著提高TOR基因在體外培養(yǎng)IEC中的表達作用，表明Leu能夠促進IEC的分裂增殖，其中Leu在培養(yǎng)液中的最佳濃度為100～150mM。

（略）