AAV-AS聯合環磷酰胺治療大鼠皮下膠質瘤效果觀察

王 冠,黃 楹,馮珂珂,李耀華,王增良

(1天津中醫藥大學第二附屬醫院,天津 300151;2天津環湖醫院)

膠質瘤多呈浸潤性生長,預后較差,瘤組織內的血管密度與其惡性程度及預后呈正相關。血管抑素(AS)是近年來發現最有效的血管生成抑制劑之一,但其在血液循環中半衰期很短,很快被清除,故效果欠佳?；蜣D移方法能在局部持續表達抗血管生成蛋白。環磷酰胺(CTX)是臨床常用的氮芥類藥物。2008年 3月 ～2009年 2月,我們采用腺相關病毒為載體AS重組質粒(AAV-AS)聯合CTX治療大鼠皮下膠質瘤,效果較好?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 材料 C6腦膠質瘤細胞系;健康SD大鼠24只,體質量270～320 g,雌雄不限;AAV-AS質粒,由上海吉瑪制藥技術有限公司構建;CTX,細胞凋亡染色檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 膠質瘤細胞培養 將C6細胞常規培養于RMPI1640培養基中,于37℃、5%CO2培養箱中培養,12 d換液 1次。將處于對數生長期的細胞消化、離心后,用不含血清的RMPI 1640培養基吹打后計數,再次離心洗去血清及胰酶;加入不含血清的RMPI 1640中制成細胞懸液,調整細胞濃度為1× 107/ml。

1.2.2 大鼠膠質瘤模型的建立與分組 將C6細胞接種于24只SD大鼠右側腹股溝皮下,7 d后腫瘤長至 250～280mm3時將大鼠隨機分為 4組各 6只。對照組腹腔內注射生理鹽水 0.1 ml,連續注射4 d,間隔3 d后重復,共3個療程;CTX組腹腔內注射CTX 20mg/kg,療程同對照組;AAV-AS組一次性腹腔內注射0.1 ml AAV-AS(3×109pfu/ml);聯合組腹腔內注射AAV-AS、CTX,劑量及給藥時間同前。

1.2.3 腫瘤體積觀察 開始治療后每隔3 d以電子游標卡尺測量并記錄腫瘤長徑(L)和短徑(W),根據公式V=π/6×LW2計算腫瘤體積。

1.2.4 膠質瘤組織中微血管密度(MVD)測算 采用免疫組化染色法標記抗CD31抗體計算MVD。于治療后第 22天處死大鼠,取腫瘤組織。每個腫瘤取最外邊、中心和次外邊 5個切片,每切片隨機選擇10個100倍視野(HP,0.24mm2)的血管平均數量。

1.2.5 腫瘤細胞凋亡檢測 采用TUNEL法。腫瘤組織切片,依次經二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,20 μg/m l蛋白酶K消化20 min,0.1%Triton檸檬酸鈉緩沖液洗滌5 min(4℃)后,滴加50μl TUNEL混合液于切片上,37℃孵育l h,PBS漂洗后,滴加50μl Converter POD于切片上,37℃孵育30 min, PBS沖洗后,0.05%DAB顯色15～20 min。于暗背景視野內,呈亮色的點為發生凋亡的細胞,進行凋亡細胞計數,計算凋亡指數(AI)。AI=凋亡細胞數/細胞總數 ×100。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。組間比較使用Bonfferoni t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腫瘤體積比較 對照組腫瘤體積為(2 060.339±82.028)mm3,CTX組為(1 763.867± 124.237)mm3,AAV-AS組為(1 229.910±141.646) mm3,聯合組為(1 098.320±70.880)mm3,聯合組與其他組比較,P均＜0.05。

2.2 各組腫瘤組織MVD比較 對照組MVD為(20±3)條/HP,CTX組為(18±5)條/HP,AAV-AS組為(13±2)條/HP,聯合組為(8±3)條/HP,聯合組與其他組比較,P均＜0.05。

2.3 各組腫瘤細胞AI比較 對照組AI為1.442 ±0.329,CTX組為1.719±0.464,AAV-AS組為3.653±0.238,聯合組為 3.886±0.361,聯合組與對照組及CTX組比較,P均＜0.05,但與AAV-AS組比較,P＞0.05。

3 討論

O′Reilly等于1994年從Lewis肺癌大鼠的血清和尿液中分離出相對分子質量為38 kD的蛋白,即為AS。研究表明,AS能特異性地抑制內皮細胞的增殖,而對其他類型的細胞如腫瘤細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等的增殖無影響[1]。因此,利用血管生成抑制劑特異性地抑制血管內皮細胞的增殖,理論上可抑制腫瘤的生長和轉移而不影響其他宿主細胞[2]。但 AS半衰期很短,在血液循環中很快就被清除,因此如果要維持病灶局部的濃度以達到治療效果,就需要長時間持續用藥,治療費用非常昂貴。

將病毒作為基因治療載體首先需要考慮的是其安全性,特別是需要大量的病毒作為治療性基因傳遞的載體。AAV具有其他病毒載體所沒有的優勢,即野生型AAV不會產生任何人類疾病。將AAV用于基因治療實驗至今,尚未發現AAV載體引起的組織炎癥及其他細胞免疫反應[3];并且AAV的DNA微陣列研究表明,AAV的基因表達對細胞突變的作用非常小[4]。研究表明,轉導 AAV后,肌內、支氣管內、肝動脈和視網膜下可檢測到較低水平和暫時存在的AAV;分析患者體液也顯示,AAV在尿、唾液和血清中可以短期存在。其在體內被宿主細胞免疫清除時間不超過 6周[5]。基因治療是將外源基因通過基因轉移方式導入患者體內,表達相關蛋白并發揮相關功能,最終達到直接或間接治療腫瘤的目的[6]。但現階段血管抑制基因治療也存在不足之處,因其作用機理不是直接殺死腫瘤細胞,而是通過抑制血管的生成而使腫瘤因缺乏養分停止生長,大部分腫瘤細胞發生凋亡、壞死,但有部分瘤細胞進入休眠狀態。這些休眠的腫瘤細胞在血管促進生長因子的作用下,可以重新復蘇[7]。所以,血管抑制療法需聯合其他方法,才有希望治愈腫瘤。本研究顯示,單純應用AAV-AS治療可明顯抑制腫瘤體積生長,使新生血管密度降低,病灶內凋亡細胞增多,證實AAV-AS可以通過抗血管生成途徑達到抑制膠質瘤生長的作用。

CTX是臨床常用的氮芥類藥物,其抗血管生成作用表現為雙階段性,在低劑量階段表現為對內皮細胞的特異性抑制作用,在高劑量階段表現為非選擇性的細胞毒作用[8]。本研究采取低劑量、高頻率給藥方法,從而避免了大劑量給藥產生的細胞毒性作用對實驗結果的干擾。本研究發現,CTX可抑制腫瘤體積生長、減低血管密度,但對腫瘤細胞凋亡無影響,其原因可能與我們采用低劑量CTX化療有關。其作用機制為抗血管生成途徑抑制腫瘤的生長,從而間接促進腫瘤細胞的凋亡,而非直接殺滅腫瘤細胞。

本研究也顯示,聯合組與其他三組相比,對腫瘤體積及血管內皮生長的抑制具有顯著性,但聯合治療與單獨應用基因治療對腫瘤細胞AI的影響在本研究中未體現出顯著差異,其原因可能是聯合治療低劑量CTX表現為抗血管生成作用,而非直接殺滅腫瘤細胞的結果。CTX作用機制為促進血管內皮細胞凋亡,而AAV-AS則是特異性的抑制血管內皮細胞的增殖,在抗血管內皮生長方面兩者具有協同作用。兩種方法聯合使用既填補了單獨應用化療藥物所產生的間歇期空白,減輕化療的不良反應,同時又能夠彌補基因治療的不穩定性及局限性。在此條件下,可使原發灶維持在休眠狀態,抑制轉移灶的形成和擴展,從而延緩病情發展,爭取再次手術機會。

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