非小細胞肺癌患者瘦素、OB-Rb、VEGF的表達及其臨床意義

孫雷雷，車淑玉，于洪升，蔣捍東

(青島大學醫學院附屬醫院，山東青島266003)

瘦素是肥胖基因編碼的蛋白產物，其可通過特異性激活瘦素受體(OB-Rb)，參與調節能量平衡、生殖、免疫及代謝等多種生理過程。近年研究表明，瘦素和OB-Rb(b型)與腫瘤的發生、發展密切相關，其可能參與腫瘤血管生成。血管內皮生長因子(VEGF)作為重要的正向調節因子參與微血管生成。為探討非小細胞肺癌(NSCLC)患者瘦素、OBRb、VEGF表達及其臨床意義，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2004年4月～2005年7月在我院胸外科經手術和病理證實的NSCLC患者30例，男17例、女13例，年齡47～73歲、中位年齡59歲。其中鱗癌13例，腺癌17例;肺癌TNM分期Ⅰ期12例，Ⅱ期8例，Ⅲ期10例;有、無淋巴結轉移者分別為11、19例。均無糖尿病及其他代謝性疾病，未行放、化療。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 將患者手術切除的石蠟切片標本常規脫蠟、水化后，置枸櫞酸緩沖液中經微波修復抗原，采用PV-6000二步法、免疫組化染色試劑盒說明書檢測NSCLC組織及其癌旁正常組織的瘦素、OB-Rb和VEGF。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，脂肪組織的染色結果為陽性對照。瘦素兔抗人多克隆抗體、OB-Rb羊抗人多克隆抗體(工作濃度1∶50)購自北京中杉金橋生物公司。

1.2.2 瘦素、OB-Rb和VEGF表達判定 每張切片隨機選取10個高倍視野，每個視野計數100個細胞中的陽性細胞數，取其平均值作為陽性表達數。陽性細胞染色以細胞質為主，可見棕黃色顆粒。參照文獻［1］制定免疫組化半定量標準，先對染色強度記分:0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色;再對陽性細胞所占百分比記分:0分為無著色細胞，1分為陽性細胞＜10%，2分為陽性細胞10% ～50%，3分為陽性細胞51% ～75%，4分為陽性細胞＞75%。染色強度與陽性細胞百分比乘積＞3分為免疫反應陽性，≤3分為陰性。

1.2.3 統計學方法 采用 SPSS17.0統計軟件，瘦素、OB-Rb、VEGF表達及其與臨床病理參數的關系用χ2檢驗、Fisher精確檢驗，相關分析用 Spearman相關性分析;用Cox回歸模型進行多因素預后分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 瘦素、OB-Rb、VEGF 在 NSCLC、癌旁正常組織中的表達 在NSCLC、癌旁正常組織中，瘦素陽性表達位于細胞質，可見棕黃(褐)色染色，瘦素陽性者分別為21(70.0%)、6 例(20.0%)，兩者陽性率比較P＜0.05;OB-Rb陽性表達主要位于細胞質，部分表達在細胞膜，可見棕黃(褐)色染色，OB-Rb陽性者分別為22(73.3%)、13 例(43.3%)，兩者陽性率比較P＜0.05;VEGF陽性表達主要位于細胞質，細胞膜呈彌散或局灶分布，可見棕黃(褐)色染色，VEGF 陽性者分別為28(93.3%)、8 例(26.7%)，兩者陽性率比較P＜0.05。

2.2 瘦素、OB-Rb、VEGF表達與NSCLC臨床病理特征的關系 Fisher精確檢驗顯示，在NSCLC組織中，瘦素、OB-Rb、VEGF表達與其病理類型、淋巴結轉移及TNM分期均無相關性(P均＞0.05)。

2.3 相關性分析 Spearman相關性分析顯示，NSCLC組織中的瘦素與OB-Rb、OB-Rb及VEGF表達均呈正相關(r分別為 0.428、0.443，P 均 ＜0.05)。

2.4 瘦素、OB-Rb表達與NSCLC預后的關系 術后隨訪6～60個月，NSCLC患者的5 a生存率為43.3%，其中瘦素陰性、陽性患者分別為77.8%、33.3%，瘦素陽性患者的生存率明顯低于陰性患者(P＜0.05);OB-Rb陰性、陽性患者分別為62.5%、40.9%，OB-Rb陽性患者的生存率低于陰性患者(P＜0.05)。多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期、瘦素是影響NSCLC預后的獨立風險因素(P＜0.05)，OB-Rb、VEGF表達與其預后無相關性(P＞0.05)。

3 討論

1994年，Zhang等［2］成功克隆了小鼠的肥胖基因及人類同源序列，闡明了肥胖基因蛋白產物瘦素的分子結構和生理作用。Stavros等［3］研究發現，瘦素在體內有促血管形成作用;瘦素與瘦素中和抗體結合后，其促血管生成作用消失。Ponnandai等［4］提出，瘦素還有促腫瘤生長的作用。瘦素發揮作用需通過OB-Rb，OB-Rb屬Ⅰ類細胞因子家族，廣泛分布于中樞和外周組織。1999年，Takahumi等［5］采用RT-PCR檢測發現肺組織中存在OB-Rb b型。OBRb不含內源性酪氨酸激酶結構域，其通過JAK/信號轉導及轉錄活化因子(STAT)途徑轉導發揮作用［6］。JAK/STAT途徑是多種細胞因子和生長因子與其相應受體結合后，激活JAK等酪氨酸激酶，使STAT磷酸化;然后形成二聚體轉位至細胞核中，與DNA上的靶基因結合，激活靶基因轉錄。Hakansson-Ovesjo等［7］研究發現，瘦素缺陷小鼠的STAT蛋白表達下調。近年研究證明［8］，瘦素和OB-Rb在宮頸癌、結直腸癌、NSCLC等惡性腫瘤組織中表達，提示二者與腫瘤的發生、發展密切相關。另有研究證實，血管生成在腫瘤的生長、轉移中起重要作用，誘導血管生成可促進腫瘤生長和轉移，當腫瘤生長至2 mm3時，如缺乏新生血管提供營養，則腫瘤細胞停止增殖。Enzo等［9］提出，VEGF作為重要的正向調節因子，參與NSCLC的微血管生成，在其發生、發展和轉移中起重要作用。Niu等［10］用染色質免疫沉淀法發現，STAT3蛋白在體內結合于VEGF啟動子后，VEGF啟動子上的STAT3蛋白結合位點發生突變，可致后者介導的VEGF活性消失;體內STAT3蛋白活性增強可上調VEGF表達，促進血管生成;反之，可阻斷STAT3蛋白信號傳導，下調VEGF表達。胥文春等通過免疫組化檢測證實，NSCLC組織中的STAT3蛋白與VEGF陽性表達呈顯著正相關。由此推斷，瘦素通過JAK/STAT途徑上調VEGF表達，后者促進腫瘤血管生成，在NSCLC的發生、發展和轉移中發揮作用。

本研究發現，NSCLC組織中瘦素、OB-Rb、VEGF的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，提示三者在NSCLC組織中呈異質性高表達，且在肺癌發生過程中有活躍的血管增殖;并發現瘦素與OB-Rb、OB-Rb與VEGF有相關性，證實瘦素與OB-Rb結合后可能通過信號轉導上調VEGF表達，通過VEGF高表達促進NSCLC組織中的血管生成。本研究還顯示，NSCLC組織中的瘦素、OB-Rb、VEGF表達與患者的性別、病理類型、淋巴結轉移和TNM分期均無明顯關系，提示檢測NSCLC組織中的瘦素、OB-Rb表達對判斷其惡性程度及病情轉歸無明顯價值。本研究隨訪顯示，NSCLC患者的5 a生存率為43.3%，TNM分期和瘦素陽性是影響其預后的獨立因素，提示對NSCLC患者行瘦素檢測有助于評估其預后。

［1］許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準［J］.中國癌癥雜志，1996，6(4):229-231.

［2］Zhang Y，Proenca R，Maffei M，et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue［J］.Nature，1994，372(6505):425-432.

［3］Stavros A，Anastasios J，Lambropoulou M，et al.Human leptin induces angiogenesis in vivo［J］.Cytokine，2008，42(3):353-357.

［4］Ponnandai S，David W，Stanley M，et al.Leptin is a growth factor in cancer［J］.Journal of Surgical Research，2004，116(2):337-349.

［5］Takahumi T，Hiroyuki S，Takeo H，et al.Expression of leptin receptor in lung:leptin as a growth factor［J］.European Journal of Pharmacology，1999，365(2-3):273-279.

［6］Gary S.Leptin signalling［J］.Cellular Signalling，2002，14(8):655-663.

［7］Hakansson-Ovesjo ML，Collin M，Meister B.Down-regulated STAT3 messenger ribonucleic acid and STAT3 protein in the hypothalamic arcuate nucleus of the obese leptin-deficient mouse［J］.Endocrinology，2000，141(11):3946-3955.

［8］劉暉，徐渭賢，曹麗靜，等.結直腸癌中瘦素的表達及其在血管生成中的關系［J］.山東醫藥，2009，49(36):45-46.

［9］Enzo G，Antonella F.Angiogenesis and aitiangiogenic agents in non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2001，34(4):3-7.

［10］Niu G，Wrighr KL，Huang M，et al.Constitutive STAT3 activity up-regulates VEGF expression and tumor angiogenesin［J］.Oncogene，2002，21(13):2000-2008.