體外培養和誘導人臍帶源間充質干細胞定向分化為心肌細胞的實驗研究

阮中寶，楊向軍，陳各才，朱 莉，李 偉，楊 兵，歐陽溪，潘少輝

(1蘇州大學附屬第一醫院，江蘇蘇州215006;2泰州市人民醫院;3江蘇省北科生物科技有限公司)

間充質干細胞(MSC)具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點，在一定條件下能分化成為各種功能細胞，可被應用于多種疾病的治療［1～3］。5-氮胞苷(5-aza)是胞嘧啶核苷的類似物，可引起DNA中某些胞嘧啶的低甲基化，從而參與激活表型特異性基因。2011年6～12月，本研究通過對人臍帶源間充質干細胞(hUC MSCs)體外分離、培養，并采用5-aza誘導，旨在研究其在體外誘導分化為心肌細胞的可行性。

1 材料與方法

1．1 材料 5份臍帶標本來源于泰州市人民醫院2010年9月份產科足月順產或剖宮產胎兒。主要試劑和儀器:DMEM/F12培養基(GIBCO，NVF0274);通用型SP Kit廣譜免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒、Anti-cTnI抗體(北京博奧森生物技術有限公司);倒置顯微鏡(日本Olympus)。SP-9000:生物素標記山羊抗兔、大鼠和豚鼠IgG;SP-9001:生物素標記山羊抗兔IgG;SP-9002:生物素標記山羊抗小鼠IgG。

1．2 實驗方法

1．2．1 hUC MSCs的分離和培養 取采集24 h內的新鮮臍帶至培養平皿中，將臍帶沿結扎內側剪斷，取中間部分。加入適量的生理鹽水，洗滌臍帶至表面干凈無血，將臍帶移至另一培養平皿中;將臍帶剪成2～3 cm的小段，沿靜脈血管剪開，將靜脈血管壁和動脈血管剝離;將華通膠剝離，用組織剪剪碎至1 mm3大小，接種于T75培養瓶中，培養液為10 ml含10%FBS的DMEM/F12，倒置顯微鏡觀察細胞形態。待細胞60%融合后，1∶3傳代。傳至3代后，部分細胞冷凍保存，部分細胞用于實驗。整個過程在無菌條件下進行。

1．2．2 hUC MSCs的誘導 P3代細胞常規消化收集，用PBS清洗2次，調整細胞密度為2×104/ml，重新接種于24孔培養板中，培養24 h待細胞貼壁(約10%融合)，培養液中加入終濃度為10 μmol/L的5-aza培養24 h，吸去含5-aza的培養液，用PBS洗滌2次，改用完全培養液繼續培養，設對照組5-aza的濃度為0 μmol/L，其他操作相同。持續培養4周，每3 d換液1次。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長和形態學的變化，分別于誘導前和誘導后1、2、3、4周進行拍照。

1．2．3 hUC MSCs免疫組化鑒定 將載有誘導分化4周后的MSC和對照組MSC的蓋玻片用PBS液輕輕洗滌浸泡5 min，按試劑盒說明書操作;顯微鏡下拍照，細胞質中出現棕黃色顆粒者為陽性細胞。

2 結果

2．1 誘導前后hUC MSCs形態變化 誘導前為典型的梭形，核/質比例高，胞質量少而均勻，無顆粒、細絲樣結構，核內可見明顯核仁，細胞呈同心圓或漩渦樣生長;處理24 h后，僅有少量細胞死亡;誘導后1～2周，細胞形態出現變化。細胞多緊密平行排列生長，細胞體積變大，紡錘形細胞比例下降，多數細胞呈桿狀，少部分細胞呈不規則外形、長梭形或橢圓形;3～4周，細胞增殖減慢，部分細胞脫壁死亡，細胞數量較同期未經誘導組明顯減少，相鄰細胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，細胞核質比例明顯降低，胞質內有細小的顆粒樣結構、且多聚集于細胞核周圍，大約30%左右細胞胞質內可見細絲樣結構。對照組未見肌管狀細胞出現。

2．2 hUC MSCs免疫組化鑒定結果 經免疫組化試劑鑒定，誘導組細胞均能著淺褐色，即cTnI表達為陽性，對照組細胞未能著色，即cTnI表達為陰性。

3 討論

最近研究表明，應用MSC移植有可能取代受損心肌細胞并建立新的血管來改善供血及心功能，從而為心肌梗死的治療開辟了一條嶄新途徑。

目前MSC的主要來源為成人骨髓和胎兒臍帶血，但成人骨髓MSC數量級增殖分化潛能隨供者年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且采集需行骨髓穿刺，來源受到限制［4］。臍帶來源廣泛，便于取材，對供者無不利影響，無倫理道德問題的限制，且細胞增殖、分化能力較強，適合體外大規模培養。因此，hUC MSCs有望成為骨髓MSC的理想替代來源。

目前用于臍帶源間充質干細胞的培養組織主要是臍帶 Wharton膠和臍靜脈［5，6］，獲取方法主要有酶消化法、組織塊法等。本研究初步建立了臍帶Wharton膠組織塊法培養和用5-aza誘導hUC MSCs體外定向分化為心肌細胞的實驗體系，5-aza誘導3～4周，相鄰hUC MSCs細胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，大約30%hUC MSCs細胞質內可見細絲樣結構。肌鈣蛋白是心肌細胞中的一種調節蛋白，參與調節收縮蛋白的舒縮活動，由3個亞單位組成，cTnI是其中之一，hUC MSCs經5-aza誘導分化后，cTnI免疫組化染色陽性，與文獻［7］報道一致，提示分化后的細胞已經合成了心肌所特有的物質，表明hUC MSCs在體外誘導分化為心肌細胞，為今后細胞移植治療心肌梗死提供了實驗依據。

［1］Si YL，Zhao YL，Hao HJ，et al．MSCs:biological characteristics，clinical applications and their outstanding concerns［J］．Ageing Research Reviews，2011，10(1):93-103．

［2］Parekkadan B，Milwid JM．Mesenchymal stem cells as therapeutics［J］．Annual Review of Biomedical Engineering，2010，12(1):87-117．

［3］Motaln H，Schichor C，Lah TT．Human mesenchymal stem cells and their use in cell-based therapies［J］．Cancer，2010，116(11):2519-2530．

［4］Yu JM，Wu X，Gimble JM，et al．Age-related changes in mesenchymal stem cells derived from rhesus macaque bone marrow［J］．Aging cell，2011，10(1):66-79．

［5］Troyer DL，Weiss ML．Wharton＇s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population［J］．Stem Cells，2008，26(3):591-599．

［6］Kestendjieva S，Kyurkchiev D，Tsvetkova G，et al．Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord［J］．Cell Biol Int，2008，32(7):724-732．

［7］ Roura S，Farre J，Galvez C，et al．Umbilical cord blood-derived stem cells spontaneously express cardiomyogenic traits［J］．Transplantation Proceedings，2007，39(7):2434-2437．