ICU病房鮑曼不動桿菌的耐藥表型及 β內酰胺酶基因型檢測

(勝利油田中心醫院,山東東營 257034)

近年來隨著廣譜抗生素的使用,鮑曼不動桿菌對臨床常用抗生素的耐藥性逐年增加[1]。2005年 1月～2010年 6月,本研究對 309株鮑曼不動桿菌耐藥表型和常見 β-內酰胺酶基因類型進行檢測。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 309例鮑曼不動桿菌菌株分離自勝利油田中心醫院 ICU病房確診鮑曼不動桿菌感染的患者痰、創面分泌物、血、尿、膽管引流液、大便、腦脊液、胸水、腹水。使用 VITEK60細菌自動鑒定儀及NFC鑒定卡鑒定菌種,標準菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌 ATCC27853。抗菌紙片亞胺培南(IPM)、哌拉西林(PIP)、哌拉西林 /他唑巴坦(TZP)、氨芐西林/舒巴坦 (ASM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢哌酮 /舒巴坦(SCF)、阿米卡星(AK)、復方新諾明(SXT)、左旋氧氟沙星(LEV)、氨曲南(ATM)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲松(CRO)。M-H培養基。

1.2 鮑曼不動桿菌菌株耐藥表型檢測 采用 K-B紙片擴散法。實驗方法和判讀標準均按照美國 NCCLS規定(M 100-S21-2011版)進行。

1.3 鮑曼不動桿菌菌株 β-內酰胺酶類型檢測 采用改良三維試驗大平皿法。以 Nitrocefin紙片鑒定出現紅色為陽性結果,1 h后無顏色變化為陰性。以超聲破碎法制備 β-內酰胺酶粗提物,頭孢硝噻吩顯色法檢測提取物。按照文獻[2]的方法操作,加入待測樣本,放置平皿于 35℃溫箱過夜培養 18～24 h,平皿上抑菌圈出現變形為陽性,反之為陰性。

1.4 鮑曼不動桿菌菌株 β-內酰胺酶基因類型的檢測 分別采用 Qiagen Plasmid Minikit及手工堿裂解法提取質粒。①單一引物 PCR擴增法檢測 OXA型β-內酰胺酶基因 OXA-23、OXA-24,方法參考文獻[3]。②多重引物 PCR擴增法檢測 ESBLs和AmpC酶基因,ESBLs的 3對引物及 AmpC的 6對引物設計及 PCR反應步驟參考文獻[4]。將所得擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳觀察,并用凝膠成像系統掃描成像進行分析。

2 結果

2.1 鮑曼不動桿菌對 13種抗菌藥物的耐藥率2005年鮑曼不動桿菌對 IPM、AK、SXT、ASM、FEP、CAZ、TZP、PIP、ATM、CTX、CRO的耐藥率分別為5.0%、15.2%、20.3%、21.4%、18.8%、20.5%、30.0%、38.4%、18.8%、18.6%、19.9%;2006年鮑曼不動桿菌對 IPM、AK、SXT、ASM、FEP、CAZ、TZP、PIP、SCF、LEV、ATM、CTX、CRO的耐藥率分別為6.0%、21.4%、25.8%、34.2%、20.5%、14.3%、40.3%、50.4%、10.3%、11.3%、20.5%、11.9%、14.5%,2007年分別為 3.0%、19.5%、24.1%、42.5%、25.8%、30.4%、33.3%、46.3%、29.1%、19.2%、25.8%、45.6%、31.1%,2008年分別為2.7%、22.5%、27.6%、32.6%、35.4%、40.2%、47.1%、61.2%、38.8%、22.6%、35.4%、46.6%、39.6%,2009年分別為 3.6%、23.3%、25.3%、23.1%、42.8%、36.1%、56.2%、77.4%、47.2%、34.5%、42.8%、33.2%、28.9%,2010年分別為3.2%、29.5%、35.1%、23.5%、40.2%、34.2%、33.2.%、58.2%、39.1%、23.1%、40.2%、30.6%、33.5%。

2.2 菌株 β-內酰胺酶類型檢測結果 309株鮑曼不動桿菌中,294株產 β-內酰胺酶。其中 171株能經改良三維試驗大平皿法進行酶分型:單獨產碳青霉烯酶 6株、產 EsBLsls 23株、產 AmpC酶 8株 ,產IRTsls 27株;同時產碳青霉烯酶和 ESBLs的有 8株,產 AmpC酶和 ESBLs的有 13株,同時產碳青霉烯酶和 IRTs的有 10株 。

2.3 PCR擴增電泳結果 在 IMP中介或耐藥的 53株鮑曼不動桿菌中,有 11株擴增到 blaOXA-23。對CTX/CAZ均耐藥的 183株鮑曼不動桿菌中,產 ESBLs組 75株,多重 PCR檢測到 12株陽性,分別攜帶blaCTX-M-13、blaCTX-M-14各 3株,同時攜帶blaSHV和 blaCTX-M-1共 6株 ;產 ESBLs組 108株中多重 PCR均陰性。對 FOX中介或耐藥的 281株鮑曼不動桿菌中,產 AmpC酶組 36株,多重 PCR僅檢測到 3株 AmpC基因陽性。不產 Ampc酶組 245株,多重 PCR檢測到 5株攜帶 blaDHA。

3 討論

鮑曼不動桿菌以其生存能力強、耐藥率高已成為重要的院內感染條件致病菌,可引發肺部院內感染、敗血癥、泌尿系感染、繼發性腦膜炎等[5]。

本研究中,鮑曼不動桿菌對 β-內酰胺類抗生素耐藥率除 IPM外均在 27.9%～77.9%。其對頭孢SCF及 ASM耐藥率相對較低,因為舒巴坦可抑制 β-內酰胺酶,又可通過作用于細菌的青霉素結合蛋白(PBP)而在體內增強其抗藥活性[6]。氨基糖甙類抗生素中,AK耐藥率較低(29.5%),但該藥單獨使用療效不佳。LEV耐藥率達到 39.3%,這與近年來臨床大量使用這類藥物有關。本研究結果顯示,鮑曼不動桿菌對 IPM耐藥率最低(＜3.6%),可能與該藥臨床應用時間較短,且抗菌作用強、與第三代頭胞菌素無交叉耐藥性、對多數 β-內酰胺酶穩定有關[6]。

本研究采用 OXA-23、OXA-24兩種酶基因引物將對 IPM中介或耐藥的 53株鮑曼不動桿菌的基因進行 PCR擴增,結果發現,11株 blaOXA-23陽性,blaOXA-24陰性。而感染攜帶 blaOXA-23基因的鮑曼不動桿菌(33株)者,其臨床資料完整的 25例中有 23例被診斷為院內感染,說明存在對 IPM耐藥的鮑曼不動桿菌醫院感染流行,且基因型為blaOXA-23。產 OXA-23型和 0XA-6型碳青霉烯酶可能是鮑曼不動桿菌對 IPM、美羅培南等碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制[7]。

目前已知大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌等易生產 ESBLs,AmpC酶由腸桿菌科細菌或綠膿假單胞菌的染色體或質粒介導產生。本研究對鮑曼不動桿菌的 ESBLs、AmpC酶兩種 β-內酰胺酶基因進行多重 PCR檢測,僅發現 3株 ESBLs基因型陽性,5株 AmpC酶基因型陽性,兩者陽性率均低。說明鮑曼不動桿菌中這些基因型者可能屬于散發,可能與耐藥鮑曼不動桿菌醫院感染流行無關。然而該結果提示腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌向鮑曼不動桿菌質粒的水平傳遞已經存在。

此外,本研究對于整合子所導致細菌多藥耐藥檢測沒有涉及。整合子可造成多種耐藥基因在不同菌株其至不同菌種間的水平轉移,對其進行研究,也有助于做好細菌耐藥性的監控工作[8]。

[1]潘曉龍,周東升,富錚,等.鮑曼不動桿菌耐藥監測及氨基糖苷修飾酶基因分布[J].國際檢驗醫學雜志,2007,28(4):298-303.

[2]Jiang XF,Hong XH,Sun JY,et al.Analysis of beta-lactamase in multi-resistantpseudomonasaeruginosa[J].Chin JMicrobiol Immunol,2002,22(4):443-446.

[3]Bou G,Oliver A,Martinez-Beltran J.OXA-24,a novelclass Dβlactamase with carbapenemaseactivity in an acinetobacter baumannii clinical strain[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44:1556-1561.

[4]Lewis JS,Herrera M,Wickes B,et al.First reportof the emergence of CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases(ESBLs)as the predominant ESBL isolated in a U.S.health care system[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51:4015-4021.

[5]朱旭慧,孫自鏞,簡翠,等.不動桿菌屬的耐藥性分析[J].中國抗感染化療雜志,2005,5(6):342-345.

[6]王春新,謝國強,嚴子禾,等.耐亞胺培南細菌的臨床分離及耐藥譜分析[J].國外醫學:臨床生物化學與檢驗學分冊,2005,26(9):666-667.

[7]周東升,潘曉龍,王傳發.耐亞胺培南鮑曼不動桿菌產碳青霉烯酶基因型研究[J].國際檢驗醫學雜志,2010,31(7):631-633.

[8]唐吉斌,周東升,徐元宏.整合子在鮑曼不動桿菌耐藥中的作用研究[J].國際檢驗醫學雜志,2010,31(5):420-424.