蜜蜂傳染性疾病的實驗室診斷技術

任 勤，戴榮國，郭 軍，王瑞生，姬聰慧

（重慶市畜牧科學院蜂業研究所，重慶 榮昌 402460）

蜜蜂傳染性病害主要包括歐洲幼蟲腐臭病、美洲幼蟲腐臭病、敗血病；囊狀幼蟲病、麻痹病等；白堊病、黃曲霉病等；螺原體病以及侵襲性疾病中的蜜蜂微孢子蟲病、阿米巴病。這些疾病往往是危害養蜂生產的主要疾病。

1 主要診斷方法

1.1 培養鏡檢診斷方法 此方法主要用于鑒定蜜蜂細菌病、真菌病及原生動物引起的疾病，并且要求病菌在形態和染色上具有明顯的特征。在沒有細胞系可利用的情況下，培養是不能夠利用的。病原培養是診斷的基礎和核心，對于不同的病原要加以區分，并且有的病原在培養條件上有嚴格的要求（如蜜蜂幼蟲芽孢桿菌），這就給鑒定帶來了一定的難度。Alippi在1995年發明了一種半選擇培養基，該培養基含有萘啶酸和吡哌酸，能夠在幼蟲芽孢桿菌孢子萌發之前抑制大部分芽孢桿菌的生長，為芽孢桿菌的培養提供了依據。Peter E.Lee和B.Furgala在1965年和1967年先后用鏡檢法對蜜蜂囊狀幼蟲病進行了檢測。有些病原體到目前為止，還沒有可行的體外培養方法（如蜜蜂微孢子蟲），而且體外培養耗時，不能夠規模化進行。

1.2 免疫學診斷方法 免疫學診斷建立在抗原與相應抗體發生可見反應這一原理的基礎上，有的反應不可見或難測，可以通過應用補體、溶血以及熒光素、酶和同位素標記等指示物質，使其反應成為可見或可測的狀態。血清學方法具有嚴格的特異性和較高的敏感性，在傳染病的診斷、病原微生物的分類和鑒定以及抗原分析、免疫抗體監測等方面，均有較廣泛的應用。其優點不僅表現在可利用抗體來診斷未知的抗原或用已知的抗原來診斷未知抗體，還可以進行定量定性分析。血清學診斷方法很多，目前用于蜜蜂傳染病診斷的主要有瓊脂免疫擴散法、對流免疫電泳法、熒光抗體法（IFA）和酶聯免疫吸附法（ELISA）。高純度抗體的獲得是進行血清學診斷的核心問題，目前主要是通過差速離心法獲取。

1.2.1 瓊脂免疫擴散法 免疫擴散法的原理：抗體和抗原在同一凝膠內擴散，兩者相遇后會出現具有一定特征的沉淀帶，從而判斷抗體是否存在或者抗原性是否一致。Denis L.Anderson對蜂王黑變病病毒（BQCV）、慢性麻痹病毒（CBPV）、克什米爾病毒（KBV）和囊狀幼蟲病病毒（SBV）利用瓊脂免疫擴散法進行了檢測，結果證明此方法只有千分之一的敏感性，且特異性不明顯。

瓊脂本身性質易受溫度影響，溫度過低，易凍住而變硬失效；溫度偏高，則擴散環模糊，誤差偏大。瓊脂擴散法對加血清的要求嚴格，首先是加樣器，有條件者可選用微量移液管，并且應垂直并完全加入孔中，切勿使樣品外溢，否則結果不準確；瓊脂擴散法在測量沉淀環直徑時，除用米尺外，可改用目鏡測微器，其誤差小于0.1mm，效果更好。瓊脂擴散板在溫箱內要保持水平狀態，擴散時間不得超過48h，否則沉淀環可能呈橢圓形，不便測量；瓊脂擴散法室內重復性不理想；瓊脂擴散法是以沉淀環直徑與抗原含量的直線關系來繪制標準曲線的，如曲線繪制不精密，誤差也會相應增大。

1.2.2 對流免疫電泳法 對流免疫電泳法的原理：抗原在堿性緩沖液中（pH 8.4以上）帶負電荷，可由負極向正極移動，而血清中抗體接近等電點，由于電滲作用，可由正極向負極滲透，兩者在短時間內相遇后，出現白色沉淀線，根據沉淀線存在與否及沉淀量的多少，可以定量檢測出樣品中抗原或抗體的存在及含量。根據出現沉淀線和抗原稀釋倍數最高一孔的稀釋度，可以測定出被測血清的效價和應用價值。

本法由于電場的作用，限制了抗原、抗體的自由擴散，使其定向泳動，因而增加了試驗的靈敏度，并縮短反應時間。此法操作簡便，僅需30～60min，靈敏度比雙向瓊脂擴散高10～15倍，但缺點是特異性不如雙向瓊脂擴散高。

1.2.3 熒光抗體法 熒光抗體法的原理是利用異硫氰熒光素與抗體或者抗原生成復合物，以此測定抗體或者抗原的一種方法。熒光標記抗體與相應的抗原結合后，在熒光顯微鏡下如果有沉淀產生，則會在沉淀物弧中出現熒光。依據熒光的強度和分布，就能檢測抗原的含量和判斷抗原是否存在。

熒光抗體技術在臨床檢驗上已用于對細菌、病毒和寄生蟲的檢驗及自身免疫病的診斷等，在細菌學檢驗中主要用于菌種的鑒定。本法較其他鑒定細菌的血清學方法速度快、操作簡單、敏感性高，但在細菌實驗診斷中，一般只能作為一種補充手段使用，不能代替常規診斷。

1.2.4 酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附法（簡稱ELISA）始于20世紀70年代，是一種把抗原和抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來的檢測技術。其基本原理是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預先結合到某種固相載體表面，測定時將受檢樣品（含待測抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按一定程序與結合在固相載體上的抗原或抗體起反應，形成抗原或抗體復合物；反應終止時，固相載體上的酶標抗原或抗體被結合量（免疫復合物）即與標本中待檢抗體或抗原的量呈一定比例，經洗滌去除反應液中的其他物質，再加入酶反應底物后，底物就被固相載體上的酶催化變為有色產物，最后通過定性或定量分析有色產物量就可確定樣品中待測物質的含量。ELISA法比其他免疫學診斷方法的靈敏度高，特異性強。但也不可避免地存在著一些缺陷，如不能同時分析多種成分，對試劑選擇性高，對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應等。

1.3 PCR檢測診斷 PCR（聚合酶鏈式反應）技術是由美國科學家于1983年發明的一種特異基因或克隆序列的體外酶促擴增技術，隨后PCR技術迅速發展，各國研究人員也對其進行了不斷改進。目前已經有10余種不同類型的PCR技術廣泛應用于各個領域。

GOVAN等將PCR技術應用在蜂球囊菌的檢測上，結果表明此技術耗時短，特異性較高。LAURO等提出利用套式PCR可直接檢測蜂蜜和蜂巢中的幼蟲芽孢桿菌孢子，且靈敏度非常高，不僅可以用于美洲幼蟲腐臭病的病情預報，還可以用于實時流行病學研究。GRABENSTE INER等對不同地區的囊狀幼蟲病毒利用逆轉錄PCR進行檢測，獲得了一致的檢測結果，此方法快速、靈敏，是檢測囊狀幼蟲病病毒的有效方法。WEBSTER等利用特異性PCR引物可以迅速檢測到蜜蜂體內的微孢子蟲，與傳統的顯微鏡診斷相比,靈敏度大大提高。Elke Genersch建立了RT-PCR檢測方法，此方法在檢測蜜蜂殘翅病病毒上具有良好的呈現性。Elvira Grabensteiner等建立了復合TR-PCR，同時對蜂王黑變病、囊狀幼蟲病和急性蜜蜂麻痹病進行了檢測，進一步提高了檢測敏感性和特異性，并且重現性良好。

近年，我國利用PCR技術在蜜蜂疾病的檢測上也開始應用。周婷等利用RT-PCR對我國蜜蜂克什米爾病毒（KBV）和急性麻痹病毒（APV）進行了檢測，結果表明，到目前為止我國還沒有蜜蜂對這兩種病毒有感染。許益鵬等利用Nest-PCR對囊狀幼蟲病病毒進行了檢測，結果表明此方法可以在短時間內檢測出病毒，可用于對囊狀幼蟲病的前期診斷。李明等報道，利用RT-PCR可以快速檢測出蜜蜂是否感染囊狀幼蟲病病毒。

PCR技術相對于其他檢測方法來說，具有快速、靈敏、耗時短的優勢，但其本身也存在一些問題，例如由于各種污染引起的假陽性問題，尤其在病原微生物上表現突出；由儀器、試劑、操作等引起的假陰性問題；另外，由于蜜蜂病原樣本的采集存在一定的難度，并且病菌含量小，對檢測的靈敏度具有較高的要求。

2 結語

對蜜蜂病害的的防治目前還停留在臨床診斷階段，近幾年病害發病率有回升趨勢，而且由于臨床癥狀在初期均不典型或者呈隱性感染，容易出現誤診情況，而當出現明顯癥狀時，已經造成經濟損失。目前常用的培養鏡檢診斷由于費時費力，病原的培養條件苛刻，不能大規模進行，在實驗室診斷上意義不大。而免疫學反應，由于血清的獲取至少也得30d時間，故不能作出快速診斷，另一些血清學檢測方法獲得的抗原特異性差、敏感性低，容易和其他病原存在抗原性交叉，產生假陽性，而且不能一次確診，所以對一些潛在性或隱性傳染的疾病診斷價值不大。隨著科學技術的進步，蜜蜂疾病的實驗室診斷必然會從最初的組織形態學觀察向細胞分子診斷水平方向發展。分子技術的發展在診斷蜜蜂疾病上是一次革命，尤其是對蜜蜂病原核酸序列的破譯，將會使病原的快速檢測、診斷成為可能。

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