快速右房起搏制備豬房顫模型及其心肌組織中抗凝血酶測定的研究

李 飛，張卓琦，張超群，徐 晤，王志榮*

(1徐州醫(yī)學院研究生部，江蘇徐州221004;2徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

房顫(AF)是臨床上最常見的一種心律失常，總發(fā)病率約0.89%，其中＞60歲年齡組發(fā)病率約為5.9%［1］。栓塞是AF最重要的并發(fā)癥［2］，原因為心房內附壁血栓形成，但機制尚不明確。2008年10月，我們采用快速右房起搏法制備豬AF模型并采用質譜法(MALDI-TOF MS/MS)［3］對豬心肌組織中抗凝血酶表達進行了測定，旨在為進一步治療AF提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康家豬12只，年齡2～3個月，雌雄不拘，體質量(37.4±2.5)kg，隨機分為模型組和對照組各6只;Protein IEF cell型等電聚焦儀、ProteinⅡⅪcell型垂直電泳槽、GS-800光密度掃描儀;埋藏式高頻率起搏器(南京醫(yī)科大學);“J”形錨狀心房單極電極;固相pH梯度干膠條(IPG dry strip，pH值4～7、17cm)，乙二胺四乙酸(EDTA)，四甲基乙二胺(TEMED)，丙基硫酸鹽(CHAPS)。

1.2 AF模型制備及鑒定 ①模型制備:參考Chen等［4］快速右房起搏法并加以改良。兩組均以3%戊巴比妥鈉麻醉，采用Seldinger血管穿刺技術穿刺右側頸內靜脈，模型組植入心房單極起搏電極，用起搏分析儀測量起搏參數(電壓閾值＜1 V，阻抗500～1 000 Ω)，滿意后將電極尾端與高頻心臟起搏器相連，體外磁鐵設定參數:起搏方式為AOO，脈沖頻率520次/min，脈沖幅度≥5 V，脈沖寬度0.15 ms，測試滿意后埋置起搏器。對照組僅植入電極，不予起搏。兩組術后均常規(guī)抗感染4 d。②鑒定:AF模型制備前及制備2周后，分別采用程序刺激對兩組行電生理檢查，其中程序刺激驅動周長(S1S1)為300 ms，S1S2間期為心房有效不應期+50 ms，步長5 ms反掃直至不應期;不能誘發(fā)AF時引入S3，S2S3間期從S1S2的80%開始，步長5 ms反掃直至S3落入不應期;仍不能誘發(fā)AF時引入S4;S4未能誘發(fā)AF時，采用12 Hz、脈寬2 ms、4倍閾值的Burst(500次/min)刺激誘導。模型組經以上誘發(fā)刺激出現(xiàn)AF者為制模成功［5］，并進入下列實驗。

1.3 豬心肌組織中抗凝血酶測定①心肌組織分離及處理:兩組均于心臟電生理檢查結束后迅速開胸，取出心臟置于冰塊上，生理鹽水洗靜血液，分別剪取心房、心室及室間隔組織，分裝到EP管后置于液氮瓶中凍存24 h，轉至-20℃冰箱保存。②雙向電泳及銀染色:參照Lai等［6］方法及Bio-Rad操作手冊。自冰箱取水化上樣緩沖液I，置室溫溶解后在試管中加入0.01 g DTT，Bio-Lyte 4～6、5～7各2.5 μl，充分混勻。取出400 μl水化上樣緩沖液，加入300 μg樣品，混勻后線性加入水化盤，置入IPG膠條，覆蓋2～3ml礦物油。將聚焦IPG膠條二次平衡后從樣品水化盤中移出，浸在1×電泳緩沖液中，放置5min后進行SDS-PAGE垂直電泳，溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳(每個樣品重復3次)，通過固定、敏化、硝酸銀染色、顯影、停顯及脫色，至背景清晰。③圖像分析及質譜鑒定:采用GS-800對上述銀染凝膠進行掃描，用PD-Quest TM軟件對圖像進行背景消減、蛋白質點匹配和校正，獲取蛋白質點的位置坐標和表達量分析。選取斑點體積差異比值大于≥60且最優(yōu)離子積分≥30的差異蛋白點，切取后低溫保存送復旦大學分鑒定，采用GPS Explore Workstation-MASCOT檢索NCBInr蛋白數據庫(http://www.matrixscience.com)尋找匹配的相關蛋白質。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件行統(tǒng)計學處理。計量資料用±s表示，組內、組間比較均使用t檢驗;P≤0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AF模型制備情況 兩組術前行電生理檢查時均未誘發(fā)出AF。模型組快速起搏2周后關閉起搏器時1只豬出現(xiàn)AF，余5只豬經程序刺激或Burst刺激均可誘發(fā)出AF，AF持續(xù)時間(26.41±9.89)min;對照組AF誘發(fā)情況較術前無變化。

2.2 豬心肌組織中抗凝血酶表達 銀染后PDQuest TM軟件計算結果顯示兩組有意義靶點編號為3708，模型組和對照組平均灰階度分別為47.4、445.9(P＜0.05);靶點蛋白質譜鑒定為抗凝血酶(其蛋白質積分為254、最優(yōu)離子積分為59、標志性肽段為3)。

3 討論

由于AF發(fā)病機制仍未完全闡明，治療效果一直不盡理想，故建立理想的AF模型、深入研究AF發(fā)病機制具有重要臨床意義。20世紀90年代初，Allessie等［7］采用心外膜方法建立了慢性持續(xù)性AF動物模型，鄭方勝等［8］采用快速心房起搏法建立了兔AF模型，但其AF持續(xù)時間短、誘發(fā)率低、可重復性差。鑒于豬性格溫和，心臟形態(tài)、內部結構、血管配置均與人心臟相似，故本研究選擇豬作為實驗動物。AF有較高致殘率，Kannel等研究表明陣發(fā)性AF患者年中風率為11.3%。AF容易形成心房內附壁血栓，后者脫落可導致體循環(huán)栓塞等嚴重并發(fā)癥，但其血栓形成機制尚不十分明確;Motoki等［9］認為AF患者左心房中凝血活性增高，即使在不發(fā)作時期仍存在凝血高風險。抗凝血酶屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，相對分子質量為58 kU，由432個氨基酸組成，主要作用為抑制凝血酶和因子Xa，對Ⅺa、Ⅻa因子及纖溶酶、激肽釋放酶亦有抑制作用。研究顯示，抗凝血酶活性降低與心腦血管內血栓形成有一定相關性［10］，可能機制為引起凝血酶滅活減少、凝血功能亢進。

本研究顯示，植入心臟起搏器、快速心房起搏2周后，采用程序刺激或Burst刺激后均誘發(fā)出AF，證明此制模方法穩(wěn)定可靠。通常認為抗凝血酶由肝臟和內皮細胞合成。本研究顯示，模型組右房心肌組織中抗凝血酶表達顯著低于對照組。可能機制:模型組右房組織中內皮細胞功能受損導致抗凝血酶合成減少;其他未探明因素使抗凝血酶消耗增多。本研究未能分離心肌細胞與內皮細胞，有關抗凝血酶的具體表達位置將在今后使用其他生物學方法進一步探討。

綜上所述，快速右房起搏法制備豬AF模型穩(wěn)定可靠;AF易并發(fā)血栓形成的可能機制為其心肌組織中抗凝血酶表達降低。

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