不同缺血時段大鼠心肌組織中Nanog的表達變化及意義

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝 453100;2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院組織再生重點實驗室)

心肌缺血可導(dǎo)致心肌細胞缺氧，引起某些核轉(zhuǎn)錄因子的激活，影響干細胞分化。目前研究發(fā)現(xiàn)［1］，作為一種調(diào)節(jié)干細胞自我更新的核轉(zhuǎn)錄因子Nanog在心肌缺血的發(fā)病機制中的起重要作用。Nanog是一種存在于哺乳動物多潛能細胞和發(fā)育中的胚胎細胞中的同源結(jié)構(gòu)域蛋白，它不僅對胚胎細胞的形成特別重要，而且對體細胞多潛能表達也起調(diào)節(jié)作用［2］。2009年8月～2010年3月，我們采用RT-PCR和Western blot法觀察急性心肌缺血損傷大鼠心肌組織中Nanog mRNA和蛋白表達變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理 選用健康SD雄性大鼠30只(河南省實驗動物中心提供)，體質(zhì)量180～220 g。隨機分為假手術(shù)組(正常組)和Q1、Q2、Q3、Q4組，各6只。后四組采用冠狀動脈前降支結(jié)扎法建立心肌缺血模型［3］，以結(jié)扎后心前壁顏色變暗和ST段明顯抬高0.15 mV確定建模成功。正常組除不結(jié)扎冠狀動脈前降支外，余相同。

1.2 主要試劑 RT-PCR試劑盒，Nanog兔抗鼠多克隆抗體，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，PVDF膜(孔徑0.45 μm，ECL-Western blot試劑盒等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 各組心肌組織中Nanog mRNA及蛋白檢測

1.3.1 各組心肌組織中Nanog mRNA檢測 取正常組心肌組織，Q1、Q2、Q3、Q4組分別于心肌缺血2、6、12、24 h時取心肌組織，采用 RT-PCR 法檢測。先提取組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，半定量RT-PCR擴增 Nanog、β-actin cDNA片斷。Nanog上下游引物序列分別為5'-ATGCCTGTGATTTGTGGGCC-3'、5'-GCCAGTTGTTTTTCTGCCAC-3'，β-actin上下游引物序列分別為5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'、 5'-GCTCAGGATCTTCATGAGGT-3'。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。予以1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果拍照后用圖像分析灰度掃描，進行半定量分析。以Nanog與β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度值比值為Nanog mRNA相對表達量。

1.3.2 各組心肌組織中Nanog蛋白檢測 各組心肌組織提取同1.3.1。所有標(biāo)本－78℃保存，采用Western blot法檢測各組心肌組織中Nanog蛋白。以β-actin為內(nèi)參照。將蛋白印跡顯影圖像掃描，用Image J圖像分析軟件進行半定量分析，以Nanog蛋白灰度值與內(nèi)參照 β-actin灰度值比值為Nanog蛋白相對灰度值(灰度值與蛋白表達量成反比)。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌組織中Nanog mRNA表達結(jié)果 正常組和 Q1、Q2、Q3、Q4組心肌組織中 Nanog mRNA相對表達量分別為 0.14 ±0.04、0.15 ±0.04、0.51±0.07、0.34 ± 0.04、0.11 ± 0.04。以 Q2、Q3 組Nanog mRNA表達最高(P均＜0.05)。

2.2 各組心肌組織Nanog蛋白表達結(jié)果 正常組和Q1、Q2、Q3、Q4組心肌組織中Nanog蛋白相對灰度值分別為 3.46 ±0.37、2.59 ±0.09、2.14 ±0.98、2.44 ±0.31、3.53 ±0.55。以 Q2、Q3 組蛋白表達最高(P 均 ＜0.05)。

3 討論

有研究認為［4］，Nanog基因是“逆轉(zhuǎn)因”物質(zhì)，可以把普通細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛ゼ毎僦笇?dǎo)新細胞生長出人類需要的各種人體組織，來代替已失去功能的組織器官。最新研究表明［5］，Nanog與另兩個重要核轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2同位于細胞全能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂端，是保持胚胎干細胞自我更新和多能性的中心物質(zhì)，它們與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的蛋白或轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)節(jié)ES細胞的自我更新和全能性;同時通過調(diào)控在生物發(fā)育進程中起關(guān)鍵作用的可阻遏基因從而調(diào)節(jié)與分化有關(guān)的下游基因，調(diào)控生物的發(fā)育過程。

本實驗中，我們首先建立了急性心肌缺血模型，采用RT-PCR和Western blot方法從基因和蛋白水平對缺血心肌組織中Nanog進行研究。本研究結(jié)果顯示，正常組大鼠心肌組織中Nanog mRNA和蛋白呈微量表達，心肌缺血后2～12 h，心肌組織中Nanog mRNA和蛋白表達逐漸增加，以6～12 h增加顯著，12 h后有所下降，24 h時呈幾乎不表達，提示心肌缺血組織中Nanog表達明顯上調(diào)，其原因可能是心肌損傷后的修復(fù)反應(yīng)，Nanog高表達有利于心肌細胞增殖［6，7］。目前有關(guān)Nanog蛋白的作用靶點尚不十分清楚。Nanog蛋白作為一種轉(zhuǎn)分化抑制因子，并不終止已定型的終末分化細胞，因此高度分化的心肌細胞，還可重新啟動Nanog基因，合成Nanog蛋白，調(diào)節(jié)和促進心肌細胞再進入分裂循環(huán)［8］。

所以我們推測Nanog是心肌缺血后心臟病理生理改變的重要因素之一。缺血心肌組織中Nanog表達變化，可能在缺血后心肌重構(gòu)過程中有著重要的作用，至于其作用機制及對心功能的影響等尚待進一步研究。

［1］Li TS，Cheng K，Lee ST，et al.Cardiospheres recapitulate a nichelike microenvir-onment rich in stemness and cell-matrix interactions，rationalizing their enhanced functional potency for myocardial repair［J］.Stem Cells，2010，28(11):2088-2098.

［2］Brenner C，F(xiàn)ranz WM.The use of stem cells for the repair of cardiac tissue in ischemic heart disease［J］.Expert Rev Med Devices，2011，8(2):209-225.

［3］倪新海，部朝暉，張宇清，等.大鼠心肌梗死—心力衰竭模型動物存活率的實驗研究［J］.中國實驗動物學(xué)雜志，1999，9(4):1-6.

［4］Beltrami AP，Cesselli D，Bergamin N，et al.Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs(heart，liver，and bone marrow)［J］.Blood，2007，110(9):3438-3446.

［5］Siu MK，Wong ES，Chan HY，et al.Overexpression of Nanog in gestational trophoblastic diseases:effect on apoptosis，cell invasion，and clinical outcome［J］.Am J Pathol，2008，173(4):1165-1172.

［6］Siu MK，Wong ES，Chan HY，et al.Circulating very small embryonic-like stem cells in cardiovascular disease［J］.J Cardiovasc Transl Res，2011，4(2):138-144.

［7］Abdel-Latif A，Zuba-Surma EK，Ziada KM，et al.Evidence of mobilization of pluripotent stem cells into peripheral blood of patients with myocardial ischemia［J］.Exp Hematol，2010，8(12):1131-1142.

［8］Wojakowski W，Kucia M，Zuba-Surma E，et al.Very small embryonic-like stem cells in cardiovascular repair［J］.Pharmacol Ther，2011，129(1):21-28.