鹽地堿蓬粗蛋白的提取工藝優化及特性研究

張穎，趙姍，王晨熙，劉春艷，王磐

（華北理工大學藥學院，河北 唐山 063200）

植物蛋白以其不含膽固醇且資源豐富、價格低廉的特點，受到了廣大學者的關注[1]。目前高質量植物蛋白的提取及利用已成為人們的研究熱點。

鹽地堿蓬（Suaeda salsa）又稱黃須菜，是一種食藥同源的植物，具有多種藥理活性。其中蛋白質[2-5]、膳食纖維[6-7]、維生素、礦物質和黃酮類化合物含量豐富，且鮮嫩莖葉中蛋白質含量高達干物質的40%[8]，與大豆相仿。還發現鹽地堿蓬莖葉的蛋白質中的氨基酸種類齊全，必需氨基酸含量非常相近完全蛋白質指標[9]，優于螺旋藻、雞蛋、大豆的組成，是一種優質的蛋白質。目前較多的研究是對其營養成分[10]、氨基酸[11]種類的研究，對于鹽地堿蓬蛋白的提取及功能性研究還未見報道。

本文通過單因素試驗及響應面優化法對鹽析法進行優化，得到鹽地堿蓬粗蛋白提取的最佳工藝參數。測定鹽地堿蓬粗蛋白的功能特性和體外抗氧化活性，判定其應用價值，為鹽地堿蓬今后的開發利用提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽地堿蓬嫩莖葉：采摘于7月初曹妃甸生態城華北理工大學校園及周邊濕地（經華北理工大學藥學院劉春艷教授鑒定）。摘取其葉子洗凈，經35℃干燥、風選，采用萬能粉碎機粉碎后，過140目網篩，得鹽地堿蓬粉，密封儲存備用。

NaOH、（NH4）2SO4、DPPH、磷酸鈉、鉬酸銨：上海麥克林生化科技有限公司；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、HCl、H2SO4：天津市北方天醫化學試劑廠；95%乙醇、石油醚（60℃～90℃）：天津市津東天正精細化學試劑；CuSO4·5H2O、K2SO4、H2BO3、甲基紅指示劑、亞甲基藍指示劑、二硫蘇糖醇（L-dithiothreitol，DTT）：鄭州阿爾法化工有限公司。

1.2 儀器與設備

YH-A 6002型萬分之一電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；IKA RDT basic型磁力加熱攪拌器：艾卡（廣州）儀器設備有限公司；FDU-1200型EYELA凍干機：東京理化公司；TU-1810型紫外可見分光光度計：南京菲奇工貿有限公司；TGL-16gR型離心機：上海安亭科學儀器廠；LICHEN-165597型移液槍：力辰科技有限公司；PSM11R-120型pH計：廣州市璟騏儀器有限公司；JP-040S型超聲波清洗機：深圳市潔盟清洗設備有限公司；VORTEX-5型旋渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；DHG-924385-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

稱取一定量鹽地堿蓬粉，以料液比1∶9（g/mL）加入石油醚，攪拌均勻，低溫下超聲脫脂30min，靜置1 h，抽濾，置于30℃烘箱中烘干，得脫脂鹽地堿蓬粉末，經凱氏定氮法測定，脫脂粉末中蛋白占干物質的20.78%。

1.3.2 鹽地堿蓬粗蛋白的提取

參考文獻[12-13]的方法并適當改進，試驗方案如下：取脫脂后樣品1 g放入離心管中，加入一定比例的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS），充分混勻后低溫靜置，然后超聲輔助提取。分別調整PBS濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L，料液比 1∶9、1∶11、1∶13、1∶15、1∶17（g/mL），靜置時間 0、30、60、90、120、150 min，在40 kHz的超聲波頻率下超聲20、25、30、35、40 min，取出離心管，在 6 000 r/min、4 ℃下，離心 20 min，留上清液，按 561 g/L 加入（NH4）2SO4粉末，使溶液飽和度達80%，4℃靜置4 h后，于6 000 r/min、4℃下，離心20 min，棄上清液，留沉淀，并用PBS緩沖液溶解，放入相對分子質量為3 500的透析袋中透析24 h（4℃條件下），凍干，低溫保存。以鹽地堿蓬粗蛋白提取率（Y）為指標，優化提取條件。

1.4 鹽地堿蓬粗蛋白含量測定

標準曲線的制作：以牛血清蛋白為標準品，用移液槍分別向5只10 mL比色管中加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 5.00 mg/mL的標準蛋白溶液，再向比色管中加入0.9% NaCl溶液稀釋，至刻度線處，混合均勻。以0.9% NaCl溶液為空白對照，在283 nm處分別測定不同濃度標準蛋白溶液的吸光度A，以濃度（mg/mL）為橫坐標x，以吸光度y為縱坐標繪制標準曲線：y=0.636x+0.017 4（R2=0.998 3）。

粗蛋白提取率的測定：在283 nm處分別測定提取液的吸光值（A0）和沉淀離心后上清液的吸光值（A），通過標準曲線計算出溶液中鹽地堿蓬蛋白的含量，進而計算出沉淀中蛋白的含量，最終得到鹽地堿蓬粗蛋白的提取率，計算公式如下。

1.5 響應面設計

根據單因素的試驗結果，運用Design-Expert10軟件，依據Box-Behnken設計原理，進行響應面設計。以A靜置時間、B超聲時間、C料液比、D PBS濃度為自變量，以鹽地堿蓬蛋白提取率（Y）為響應值，設計四因素三水平的響應面優化模型。具體設計如表1所示。

表1 鹽析法試驗因素水平及編碼Table 1 Factors level and coding of salting out method

1.6 鹽地堿蓬粗蛋白功能特性的測定

通過凱氏定氮測得凍干后鹽地堿蓬粗蛋白粉末中蛋白含量為43.75%，以大豆蛋白含量為45.37%的大豆粗蛋白粉作為對照品測定鹽地堿蓬粗蛋白的功能特性。參考相關文獻[14-15]，分別測定其在不同pH值下的持水性、溶解度、起泡性和乳化性，同時對持油性進行測定。

1.6.1 蛋白質持水性的測定

取蛋白樣品0.2 g（記為m），加入不同pH值下的蒸餾水4 mL置于離心管（離心管的質量記為W1）中，充分混勻，于25℃下靜置30 min，6 000 r/min離心20 min，棄上清液，稱重（記為W2）。公式如下。

1.6.2 蛋白質持油性的測定

取蛋白樣品0.2 g（記為m），加入2 mL大豆油置于離心管（離心管的質量記為W1）中，充分混勻，于25℃下靜置30 min，6 000 r/min離心20 min，倒掉上清液，稱重（記為W2）。公式如下。

1.6.3 蛋白質的溶解度測定

準確稱取蛋白粉樣品0.2 g，向其中加入20 mL不同pH值下的H2O，超聲30 min，隨后在25℃，6 000 r/min下離心20 min，采用凱氏定氮法測定上清液中的蛋白含量。將上清液中的蛋白含量占總蛋白含量的百分比記為蛋白質的溶解度。

1.6.4 蛋白質的乳化性和乳化穩定性測定

準確配制質量濃度為1.0%的蛋白質溶液10 mL，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調溶液pH值至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，加入 5 mL 大豆油，用高速分散機對溶液進行攪打，10 000 r/min攪打 2 min后，迅速以2 000 r/min，25℃離心10 min，分別測定乳化層的高度及離心管中液體總高度，然后再在80℃水浴中對離心管進行加熱，時間為30 min，放冷后，2 000 r/min，25℃離心10min，再次對乳化層的高度進行測定，公式如下。

1.6.5 蛋白質的起泡性和泡沫穩定性測定

配制一定質量濃度為1.0%蛋白溶液20 mL，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調溶液pH值至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，采用高速剪切機對溶液進行攪打，10 000 r/min，25℃攪拌2 min，迅速倒入大量筒中對泡沫體積進行測定，記為V1。25℃靜置30 min，再次對泡沫體積進行測定，記為V2。公式如下。

1.7 鹽地堿蓬粗蛋白體外抗氧化試驗

1.7.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參考文獻[16]，進行試驗，將鹽地堿蓬粗蛋白粉末，分別配制成質量濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的鹽地堿蓬蛋白溶液，以VC為對照品進行抗氧化活性試驗。分別向棕色試管中加入 5 mL 質量濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的鹽地堿蓬蛋白溶液和相同質量濃度的VC溶液，加入2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液，混合均勻，避光反應30 min，在595 nm處測定溶液的吸光度，每組均測定3次，計算公式如下。

式中：A1為DPPH與樣品混合液的吸光度；A2為無水乙醇與樣品混合液的吸光度；A0為蒸餾水與DPPH混合液的吸光度。

1.7.2 磷鉬絡合物法測定抗氧化活性

參考文獻[17]，分別取不同濃度的樣品溶液0.2mL，0.6 mL反應液（0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨0.2 mL），混勻后置于95℃水浴中恒溫90 min，冷卻至25℃后，在波長695 nm測其吸光度A。空白液用0.2 mL溶劑代替樣品液。以VE作為對照，所有測定平行進行3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 靜置時間對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響

靜置時間對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 靜置時間對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響Fig.1 The effect of standing time on the extraction rate of Suaeda salsa crude protein

如圖1所示，鹽地堿蓬蛋白的提取率隨靜置時間的增加，呈先上升后下降的趨勢，當靜置時間在0～60 min時，蛋白提取率增長顯著，這可能是由于隨靜置時間的增加，鹽地堿蓬粉末被充分溶解，蛋白分子更易溶出，當靜置時間為60 min時，蛋白提取率為43.45%最高；當靜置時間超過60 min后，蛋白提取率下降。

2.1.2 超聲時間對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響

超聲時間對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of ultrasound time on the extraction rate of crude protein of Suaeda salsa

如圖2所示，鹽地堿蓬粗蛋白提取率隨時間的增加，呈先升高后降低的趨勢，當時間在0～30 min時，蛋白提取率隨時間增長，這可能是由于隨超聲時間的增加，鹽地堿蓬細胞壁被充分破壞，溶出的蛋白分子增加，當時間為30 min時，蛋白提取率為40.84%最高；當時間大于30 min后，蛋白提取率下降。

2.1.3 料液比對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響

料液比對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響Fig.3 The effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of Suaeda salsa crude protein

如圖3所示，隨著溶劑量增加，鹽地堿蓬粗蛋白的提取率呈先升高后降低的趨勢，當料液比在1∶9（g/mL）～1∶13（g/mL）時，蛋白提取率隨溶劑量的增加而升高，最高提取率達40.03%；繼續增加溶劑量，鹽地堿蓬粗蛋白提取率下降。這可能是由于溶劑量較小時，鹽地堿蓬脫脂粉末未完全溶解，且溶液黏性大，阻礙蛋白分子的溶出，當溶劑量增大時，鹽地堿蓬脫脂粉溶解充分，蛋白提取率隨之增加。

2.1.4 PBS濃度對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響

PBS濃度對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 PBS濃度對鹽地堿蓬粗蛋白提取率的影響Fig.4 The effect of PBS concentration on the extraction rate of crude protein of Suaeda salsa

如圖4所示，鹽地堿蓬粗蛋白的提取率隨PBS濃度的增加，呈先升高后下降的趨勢，當PBS濃度在0.01 mol/L～0.03 mol/L時，隨著PBS濃度的增大，蛋白提取率也隨之升高，這可能是由于蛋白分子間的氫鍵被破壞，使得蛋白分子溶出增加，蛋白提取率在PBS濃度0.03 mol/L處最高為42.86%；當PBS濃度大于0.03 mol/L后，蛋白提取率下降，這可能是由于PBS濃度過大時，可能會破壞蛋白分子結構，所以隨PBS濃度的增大，蛋白提取率呈下降的趨勢。

2.2 響應面優化試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗設計及結果

響應面試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface test design and results

運用Design-Expert10軟件，對以上各結果進行回歸擬合，得到以 A（靜置時間）、B（超聲時間）、C（料液比）、D（PBS濃度）為自變量，以鹽地堿蓬粗蛋白提取率（Y）為響應值的二次多項回歸方程：Y=46.12+0.14A-0.56B+0.91C+4.01D-1.07AB+0.52AC+0.15AD+0.26BC+1.00BD-0.89CD-5.08A2-3.02B2-5.11C2-3.30D2。

對回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

續表3 回歸模型方差分析Continue table 3 Regression model analysis of variance

由表3可以看出，該模型F值為6.14，P值0.0008＜0.001，表明該模型差異極顯著；失擬項P值0.139 9＞0.05，不顯著，結果表明，回歸模型可以接受；模型決定系數R2=0.859 9，說明鹽地堿蓬粗蛋白提取率與該模型擬合程度較高，能夠較好地反映不同因素與響應值（Y）的關系。模型中 D、A2、B2、C2、D2對蛋白提取率影響極顯著；A、B、C、AB、AC、AD、BC、BD、CD 影響不顯著。根據F值，各因素對蛋白提取率的影響的主次順序為PBS濃度＞料液比＞超聲時間＞靜置時間。

2.2.2 響應面各因素交互作用分析

運用Design-Expert10軟件，對以上各結果進行分析，得到響應曲面圖5。

圖5 響應面優化圖Fig.5 Response surface optimization diagram

3D曲面立體圖是各因素對蛋白提取率影響的最直觀的展示，曲面越陡，證明該因素對響應值的影響越大；曲面越緩，證明該因素對響應值的影響越微小。圖5b、圖5c、圖5e、圖5f中曲面較為陡峭，說明PBS濃度與靜置時間、料液比、超聲時間的交互作用和料液比與靜置時間的交互作用對蛋白提取率的影響較大，而且由曲面可看出，PBS濃度對蛋白提取率的影響最大，其次為料液比、超聲時間、靜置時間的影響較小，與表3的分析結果一致；圖5a、圖5d曲面平緩，說明超聲時間與靜置時間、料液比與超聲時間的交互作用對蛋白提取率的影響較小。

2.2.3 最佳工藝驗證試驗

運用Design-Expert10軟件，分析響應面試驗結果，得到蛋白提取的最佳工藝參數為PBS濃度0.042mol/L，超聲時間 30.06 min，料液比 1∶13.15（g/mL），靜置時間61.39 min，預測蛋白提取率為47.35%。在實際操作過程中，將最佳工藝參數調整為PBS濃度0.04 mol/L，超聲時間 30 min，料液比 1∶13（g/mL），靜置時間 61 min，重復3次驗證試驗，得到的蛋白提取率為（47.03±0.34）%，與模型預測值的相對偏差僅為0.32%，說明該模型能夠較好地預測鹽地堿蓬粗蛋白提取率。

2.3 鹽地堿蓬蛋白的功能特性

2.3.1 不同pH值對鹽地堿蓬蛋白持水性的影響

pH值對蛋白持水性的影響見圖6。

圖6 pH值對蛋白持水性的影響Fig.6 The effect of pH on protein water retention

由圖6可知，兩種蛋白的持水性均隨pH值的增大而下降。這是因為pH值影響蛋白分子的帶電狀態，改變蛋白質與水的相互作用強度，以及蛋白質與蛋白質之間的相互作用，從而改變蛋白的持水力。兩種蛋白均在pI（4.5）附近呈現出較差的持水性，當pH值臨近pI時，增加了蛋白分子間的相互作用力，吸水能力減弱。就整體而言，鹽地堿蓬蛋白的持水性較高。

2.3.2 蛋白持油性的測定結果

蛋白質吸收油脂的能力決定了蛋白質的持油性。在肉制品的生產加工中，蛋白質常被用作防腐劑，以吸收油脂，防止產品漏油，保證產品的良好口感。由試驗可得，鹽地堿蓬蛋白和大豆蛋白的持油力分別為（4.74±0.02）g/g和（1.90±0.04）g/g，表明鹽地堿蓬蛋白具有良好的持油效果，可用作開發吸附劑來吸附肉制品中的油脂。

2.3.3 不同pH值對鹽地堿蓬蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

pH值對蛋白乳化性和乳化穩定性的影響見圖7。

圖7 pH值對蛋白乳化性和乳化穩定性的影響Fig.7 The effect of pH on protein emulsification and emulsifying stability

由圖7可知，隨著pH值的升高兩種蛋白的乳化性大體呈現先下降后升高的趨勢。當pH值為4接近pI時，鹽地堿蓬蛋白和大豆蛋白的乳化性最小，分別為13.33%、20%，乳化穩定性也最小，分別為38%、35%；但當pH值偏離pI后，蛋白質的乳化性和乳化穩定性均增大，導致這種結果的原因在于，當pH值接近pI時，蛋白分子間靜電力較弱，蛋白質分子易聚集產生沉淀，從而減弱了蛋白的乳化性及乳化穩定性；當pH值偏離pI后，蛋白溶解度變大，分子間的作用力增強，乳化能力隨之增強。整體而言鹽地堿蓬蛋白乳化性能略低于大豆蛋白，具有相對較好的乳化效果，證明鹽地堿蓬蛋白可用作開發新的表面活性劑。

2.3.4 不同pH值對鹽地堿蓬蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響

pH值對蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響見圖8。

圖8 pH值對蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響Fig.8 The effect of pH on protein foaming and foam stability

在蛋糕、冰激凌等食品的加工中，常添加一定量的蛋白質，這是由于蛋白較好的起泡能力能夠提高食品的口感并使其結構更加蓬松[18]。由圖8可知，隨著pH值的增大，蛋白的起泡性呈先下降后上升的趨勢，而蛋白的泡沫穩定性卻與之相反，呈先上升后下降的趨勢。當pH值為4接近pI時，兩種蛋白的起泡性最小，分別為37%、33.33%，而此時泡沫的穩定性最高，分別為85.7%、80%；當pH值偏離pI時，蛋白的起泡性均變大，而蛋白的泡沫穩定性均減小。造成這種結果的原因在于，當pH值接近pI時，蛋白分子析出，使得溶液中蛋白分子減少，并且水溶液中參與氣泡形成的蛋白減少，從而使其起泡能力減弱，同時，在高速攪打時，蛋白質與泡沫通過靜電作用相結合，使泡沫厚度增加，進而提高泡沫的穩定性。綜上所述，鹽地堿蓬蛋白起泡性略高于大豆蛋白，具有較好的起泡能力，可以用作開發食品加工中的添加劑。

2.3.5 不同pH值對鹽地堿蓬蛋白溶解度的影響

pH值對蛋白溶解度的影響見圖9。

圖9 pH值對蛋白溶解度的影響Fig.9 The effect of pH on protein solubility

蛋白溶解度，是蛋白在食品加工中應用的一個重要因素，利用蛋白的溶解性，可以提高飲料的口感、風味和營養價值。由圖9所示，隨pH值的增大，蛋白的溶解度呈先下降后上升的趨勢，當pH值為4接近pI時，兩種蛋白的溶解度最小，分別為10%、3.26%；當pH值大于4后，溶解度變大，這可能由于pH值偏離pI后，蛋白分子間作用力增強，凝聚力減弱，更易溶解；pH值接近pI時，蛋白分子因靜電作用而聚集產生沉淀，溶解度降低。整體而言，鹽地堿蓬蛋白溶解性略高于大豆蛋白，具有較好的溶解性，可用作開發食品加工中的口味添加劑。

2.4 鹽地堿蓬粗蛋白抗氧化性試驗

2.4.1 鹽地堿蓬粗蛋白對DPPH自由基的清除能力

鹽地堿蓬粗蛋白對DPPH自由基的清除能力見圖10。

圖10 鹽地堿蓬粗蛋白對DPPH自由基的清除能力Fig.10 Scavenging ability of Suaeda salsa crude protein on DPPH free radicals

由圖10可知，鹽地堿蓬粗蛋白具有一定的抗氧化能力，但與VC相比，其抗氧化能力相對較弱。當質量濃度在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL內，蛋白對DPPH自由基的清除率隨鹽地堿蓬蛋白質量濃度的增加而增強，其半數清除力濃度IC50為0.757 mg/mL。

2.4.2 磷鉬絡合物法測定抗氧化活性

鹽地堿蓬蛋白的抗氧化活性見表4。

表4 鹽地堿蓬粗蛋白的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of Suaeda salsa crude protein

磷鉬絡合物法是測定抗氧化物質是否具有將Mo（VI）還原生成綠色的 Mo（V）絡合物的方法。在695 nm處測定溶液的吸光度A，A值越大，證明其還原性越強，則抗氧化性越強。由表4可知，隨著鹽地堿蓬蛋白質量濃度的增加，抗氧化活性也隨之增強。且鹽地堿蓬粗蛋白的抗氧化活性略高于VE。

3 討論與結論

3.1 討論

鹽析法提取過程中，所有的操作均在低溫環境下進行，避免溫度過高破壞蛋白結構，蛋白在鹽溶液中相對穩定，有利于對蛋白結構的保護。但在超聲時，對溫度的控制相對繁瑣，有待繼續改進。本文分別測定了在不同pH值下鹽地堿蓬蛋白的持水性、溶解度、乳化性能及起泡能力，4種結果均在等電點（pI）附近出現較為明顯的變化。這可能是因為，當pH值接近pI時，蛋白質分子間發生了一系列的物理反應，從而導致鹽地堿蓬蛋白的功能特性出現明顯的變化。

3.2 結論

本文通過單因素試驗和響應面優化法得到最佳工藝參數為PBS濃度0.04 mol/L，超聲時間30 min，料液比 1∶13（g/mL），靜置時間 61 min，為鹽地堿蓬粗蛋白的提取與開發奠定基礎。此外，在不同pH值下鹽地堿蓬粗蛋白功能特性試驗表明，當溶液的pH值接近pI時，蛋白的乳化性、乳化穩定性、溶解性、起泡性均降到最低，而泡沫穩定性最大；偏離pI后，除泡沫穩定性呈下降趨勢外，其余各項指標均呈上升趨勢。同時，體外抗氧化試驗表明，鹽地堿蓬蛋白對DPPH自由基具有一定的清除能力，對磷鉬絡合物具有一定的還原作用。本研究為更廣泛地開發利用鹽地堿蓬蛋白提供科學依據。