miR-1915-3p和Bcl-2在結腸癌組織中的表達及其臨床意義

姚曉慧

遼寧省朝陽市第二醫院病理科，遼寧朝陽 122000

近年來學者發現，微小RNA（miRNA）異常表達可能和多種惡性腫瘤的發生、 發展以及預后密切相關[1-3]。其屬于一類長度為21～25 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，對多種促癌基因和（或）抑癌基因的表達起到調控作用，繼而于細胞分化、增殖、凋亡、侵襲以及轉移等過程中起著至關重要的作用[4]。miR-1915-3p屬于miRNA 家族重要成員之一，在多種腫瘤中均存在異常低表達，但關于其和結腸癌的相關研究并不多見[5]。Bcl 是目前臨床上研究較為廣泛的一種凋亡相關性基因，可有效抑制細胞中程序性細胞凋亡，繼而誘發惡性腫瘤，可作為一種腫瘤分子標志物[6]。鑒于此，本研究通過探討miR-1915-3p 及Bcl-2 在結腸癌組織中的表達及作用意義，旨在為結腸癌的診治以及預后評估提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年2月至2016年2月遼寧省朝陽市第二醫院收治的85 例結腸癌患者作為研究對象。采集所有患者癌組織及癌旁正常組織。其中男46 例，女39 例；年齡34～79 歲，平均（57.31±10.26）歲；腫瘤部位：左半結腸37 例，右半結腸48 例；腫瘤直徑2.0～7.8 cm，平均（5.32±1.26）cm；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期44 例；分化程度：低分化34 例，中高分化51例；淋巴結轉移36 例。納入標準[7]：①所有患者均經病理檢查確診；②入院前尚未接受相關抗腫瘤治療；③均為成年人；④臨床病歷資料完整。排除標準：①伴有其他惡性腫瘤者；②意識障礙或伴有精神疾病者；③因故無法完成相關研究/檢查者。所有患者及其家屬均知情同意；本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 RT-qPCR 儀（購自德國Roche Diagnostics GmbH 公 司），Nanodrop 2000分光光度計（購自上海土森視覺科技有限公司）。石蠟包埋組織miRNA 提取試劑盒選用上海聯邁生物工程有限公司相關產品；TaqMan MicroRNA 逆轉錄試劑盒以及RTqPCR 試劑盒均選用美國Thermo Fisher Scientific 公司相關產品；相關引物均由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.2.2 檢測方式 分別制備厚度為4 μm 的結腸癌以及癌旁正常組織切片，根據miRNA 提取試劑盒說明書完成總RNA 的提取。以Nanodrop 2000 分光光度計完成RNA 樣品260 nm 處吸光度值以及280 nm 處吸光度值，以兩者比值1.8～2.1 為宜。取1 μg 的總RNA記作模板，采用TaqMan MicroRNA 逆轉錄試劑盒獲取cDNA。再取2 μl 的cNDA 作為模板實施RTqPCR 檢測，檢測miR-1915-3p 時，將U6 作為內參；檢測Bcl-2 時，將GAPDH 作為內參。引物序列如下：miR-1915-3p 正向引物5′-CAGACGACCATCAGCCCCAGGGCGA-3′，反向引物5′-CGCGGATCCATGTCTATTATTACAG-3′。U6 正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物5′-CGTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。Bcl 正向引物5′-AGTGGGATGCGGGAGATGT-3′，反向引物5′-CGGGCTGGGAGGAGAAGA-3′。GAPDH 正向引物5′-CATTCAAGACCGGACAGAGG-3′，反向引物5′-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-3′。反應條件如下：95℃預變性10 min；95℃10 s；60℃1 min；72℃30 s；共40 個循環。以2-△△Ct法計算目的基因mRNA 相對表達量。

1.3 觀察指標

比較不同組織中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA表達，分析結腸癌患者臨床病理特征（包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM 分期、分化程度以及淋巴結轉移）和miR-1915-3p mRNA 表達水平的關系。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表達水平的比較

結腸癌組織中miR-1915-3p mRNA 表達水平低于癌旁正常組織，而Bcl-2 mRNA 表達水平高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 不同組織中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表達水平的比較（±s）

表1 不同組織中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表達水平的比較（±s）

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2.2 不同病理特征結腸癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表達水平的比較

TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化程度及淋巴結轉移的結腸癌患者miR-1915-3p mRNA 表達水平低于Ⅰ～Ⅱ期、 中高分化程度及無淋巴結轉移結腸癌患者，而Bcl-2mRNA 表達水平高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化程度及無淋巴結轉移結腸癌患者，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 不同病理特征結腸癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表達水平的比較（±s）

表2 不同病理特征結腸癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表達水平的比較（±s）

項目 例數 miR-1915-3p t 值 P 值 Bcl-2 t 值 P 值年齡（歲）＜60≥60性別0.480 0.632 0.113 0.910 45 40 0.861±0.219 0.840±0.213 7.233±1.585 7.194±1.592 0.709 0.480 0.288 0.774男女46 39 0.867±0.220 0.834±0.206 7.241±1.590 7.143±1.526腫瘤部位左半結腸右半結腸腫瘤直徑（cm）＜5≥5 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中高分化淋巴結轉移0.848 0.399 0.253 0.801 37 48 0.877±0.224 0.837±0.209 7.254±1.603 7.166±1.578 0.991 0.324 1.135 0.260 32 53 0.883±0.228 0.835±0.209 7.141±1.501 7.543±1.629 3.735＜0.001 6.096＜0.001 41 44 0.938±0.279 0.751±0.174 6.120±1.456 8.245±1.734 4.264＜0.001 5.722＜0.001 34 51 0.723±0.166 0.935±0.256 8.348±1.759 6.367±1.422 5.041＜0.001 6.390＜0.001是否36 49 0.709±0.147 0.955±0.264 8.513±1.785 6.234±1.497

2.3 不同預后結腸癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表達水平的比較

對所有患者進行為期5年的隨訪，其中死亡42例，存活43 例，死亡患者的miR-1915-3p mRNA 表達水平低于存活患者，而Bcl-2 mRNA 表達水平高于存活患者，差異有統計學意義（P＜0.05）（表3）。

表3 結腸癌患者不同預后的miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表達水平比較（±s）

表3 結腸癌患者不同預后的miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表達水平比較（±s）

預后 例數 miR-1915-3p Bcl-2死亡存活t 值P 值42 43 0.741±0.202 0.954±0.236 4.466＜0.001 8.145±1.626 6.378±1.421 5.338＜0.001

3 討論

由于結腸癌往往發病具有極強的隱匿性，早期診斷率不高，絕大部分患者一經確診便已處于進展期，甚至已發生淋巴結以及遠處器官轉移，預后不良。因此，如何有效早期診斷結腸癌顯得尤為重要，亦是臨床關注的熱點。腸鏡檢查是國內外公認的診斷結腸癌金標準，但該檢查方式會對患者造成一定的創傷，臨床推廣普及存在局限性。隨著近年來相關研究的日益深入，有學者發現結腸癌的發生、發展可能涉及多基因的多階段、多步驟的復雜過程[8]。

本研究結果顯示，結腸癌組織中miR-1915-3p mRNA 表達水平低于癌旁正常組織，而Bcl-2 mRNA表達水平高于癌旁正常組織（P＜0.05）。提示miR-1915-3p 在結腸癌組織中低表達，而Bcl-2 在結腸癌組織中高表達。考慮原因，miRNA 異常表達于結腸細胞分化、 增殖以及凋亡過程中起著至關重要的作用，而miR-1915-3p 是miRNA 家族重要成員之一，介導了生物體的氧化應激、免疫細胞增殖及衰老以及干細胞自我更新等過程中，并通過對多種癌基因的表達進行調控，繼而促進了結腸癌的發生、發展[9-10]。Bcl-2 屬于癌基因家族成員之一，亦是一種凋亡基因，其表達的異常升高會導致機體內抗凋亡因子以及促凋亡因子之間的平衡被打破，繼而引發結腸癌[11-12]。此外，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、 分化程度為低分化以及淋巴結轉移結腸癌患者miR-1915-3p mRNA 表達水平低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、 分化程度為中高分化以及無淋巴結轉移結腸癌患者；而Bcl-2 mRNA 表達水平高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、 分化程度為中高分化以及無淋巴結轉移結腸癌患者（P＜0.05）。有研究報道得以佐證[13]：結腸癌組織中miR-1915-3p 及Bcl-2 的表達和患者臨床分期、分化程度以及淋巴結轉移密切相關。究其原因，miR-1915-3p 可結合至Bcl-2 中3，-UTR 上 的1249～1255 位點，進一步對Bcl-2 的表達產生抑制，從而發揮抑癌作用。而當miR-1915-3p 表達下降時，其對Bcl-2 表達的抑制作用隨之減弱，繼而促進了結腸癌患者病情的進展以及腫瘤細胞的侵襲、轉移。任宇鵬等人的研究報道表明[14]，Bcl-2 表達和結腸癌患者腫瘤大小有關，即腫瘤直徑＞5 cm 患者的Bcl-2 表達高于腫瘤直徑≤5 cm 患者。這和本研究結果存在一定的差異，導致上述差異的原因可能和檢測Bcl-2表達的方式不同有關。另外，對所有受試者均進行為期5年的隨訪，死亡患者42 例，存活患者43 例，其中結腸癌死亡患者miR-1915-3p mRNA 表達水平低于存活患者，而Bcl-2 mRNA 表達水平高于存活患者（P＜0.05）。這反映了隨著miR-1915-3p 表達水平的下降以及Bcl-2 表達水平的升高，結腸癌患者預后較差。分析原因，miR-1915-3p 的降低促使其抑制Bcl-2表達的作用下降，進一步導致抗凋亡以及抑制凋亡平衡被打破，最終抑制了結腸癌的凋亡，促進病情的進展，增加臨床治療難度，對預后產生不良影響[15]。然而，本研究亦存在一定的不足之處，如本研究在對結腸癌和miR-1915-3p 及Bcl-2 關系分析過程中僅比較了表達水平，未深入開展其他方面的研究，此舉可能導致研究結果發生輕微偏倚。因此，在今后的研究中可考慮進行影響因素或相關性等方面的分析，以獲取更為準確、可靠的數據。

綜上所述，臨床實際工作中可能通過檢測miR-1915-3p 及Bcl-2 的表達水平，繼而輔助臨床診斷結腸癌，并對患者病情以及預后進行評估。