提高牛、羊胚胎冷凍保存效果的措施

佟桂芝 宋斌 董正德 李信濤 王偉霞 李乃順

摘要：胚胎冷凍保存是胚胎生物技術的一個重要環節。在質量型畜牧業發展中起著非常關鍵的作用。而我國牛、羊體內（外）胚胎冷凍效果還沒有達到人們預期的水平，從而限制了胚胎移植技術的商業化推廣應用。需要突破的技術瓶頸問題是胚胎冷凍、解凍過程中受到機械損傷以及保護劑毒性影響。因此在胚胎冷凍保存中各種抗凍保護劑及冷凍方法要相互結合，取長補短，針對不同發育階段胚胎而篩選合適的冷凍保護劑及冷凍保存方法，同時簡化冷凍一解凍程序，我們應尋找無需昂貴的冷凍設備、操作時間短、易推廣的方法。對于胚胎冷凍胚胎移植流產率高、妊娠率及產仔率低等現象還需進一步研究。植物抗凍蛋白在豬胚胎玻璃化保存上的成功應用，使得此項技術能在畜牧業生產中得到廣泛的應用，研究內容的意義較大。

關鍵詞：牛；羊；胚胎；冷凍；保存；效果

中圖分類號：S852.1

文獻標識碼：A

文章編號：2095-9737（2018）07-0011-01

1 篩選質量優級胚胎進行冷凍保存

冷凍前羊胚胎的內細胞團的質量不高，細胞碎片多，會使每個卵裂球的完整程度差，細胞脫水與冷凍保護劑滲透到細胞過程的平衡遭到破壞。所以，掌握冷凍前根據胚胎日齡進行羊胚胎質量分級技術是關鍵技術之一。胚胎細胞形態是影響冷凍胚胎質量的關鍵因素，是直接影響移植后胚胎存活率及妊娠率的重要因素。

2 胚胎不同發育階段

胚胎冷凍能否存活的關鍵在于細胞脫水和保護劑滲透到細胞的過程是否達到平衡。用于冷凍保存的牛、羊胚胎是體內（外）受精六七天，處于桑椹、囊胚、擴張囊胚階段胚胎。處于不同發育階段的胚胎形態、細胞數量及特性均有所不同，對冷凍及解凍過程中的機械損傷及保護劑毒性的耐受能力不同。囊胚和擴張囊胚細胞數比桑椹胚的體積小而細胞數多。桑椹胚的細胞數少而體積大，胚胎細胞充分脫水難而且慢，胚胎冷凍、解凍后活力低，移植妊娠率和產仔率低。研究表明，甘油冷凍劑冷凍牛、羊胚胎，采用常規慢速冷凍法時，囊胚、擴張囊胚解凍后移植受胎率，產仔率均明顯高于桑椹胚；囊胚和擴張囊胚之間差異不顯著。表明甘油冷凍劑更適合冷凍處于囊胚、擴張囊胚階段的胚胎。對于桑椹胚：由于乙二醇冷凍保護劑的分子量小，可以快速滲入胚胎細胞，冷凍胚胎的卵裂球保持了高度的一致性，外部形態特征沒有任何的變化；甘油的分子量較大，作為胚胎冷凍保護劑時，桑椹胚卵裂球所處位置與卵裂球受保護程度有關，桑椹胚卵裂球位于桑椹胚外部的形態保存正常完整，而卵裂球位于桑椹胚內部的容易被破壞。所以，對于牛、羊不同發育階段的胚胎建議采用不同的冷凍保護劑進行冷凍保存，處于囊胚、擴張囊胚階段的胚胎宜采用乙二醇作冷凍劑，桑椹胚宜采用甘油作為胚胎冷凍保護劑效果會更好。

3 胚胎的冷凍方法

胚胎冷凍、解凍時，必須經過冷凍、解凍過程，此時的危險溫區是15℃～- 50℃。如果操作不當、冷凍保護劑選擇不當或冷凍方法不當，均能在胚胎內形成的大冰晶，對胚胎細胞造成機械性破壞，損傷蛋白質的硫氫鍵，發生胚胎死亡。因此常規的低溫冷凍法就是：在冷凍牛、羊胚胎時，篩選幾種低毒的保護劑進行搭配使用，采用合適的降溫措施，使胚胎細胞內達到玻璃化狀態時，使其能在超低溫條件下長期保存。目前已在世界范圍內進行人及哺乳動物胚胎的冷凍保存應用。常規慢速冷凍法的優點是解凍后胚胎的存活率較高，適合規模化胚胎冷凍，但這種方法胚胎冷凍程序較繁瑣、費時，成本高。玻璃化冷凍（ Vitrification）不需要昂貴的程序降溫儀，因此進行牛、羊胚胎冷凍保存的成本低廉。細胞外液不生成冰晶，避免了物理性的機械損傷對胚胎細胞造成的死亡，操作簡單。通過篩選毒性更小、滲透性更強的胚胎冷凍保護劑組合，將多種不同類型胚胎冷凍保護劑配合使用，以降低每種保護劑特有的毒性。采取冷凍劑的濃度逐步添加，當添加最終的高濃度保護劑時，在30 s內將胚胎投入液氮中等措施，從而大大降低了冷凍保護劑的毒性，提高了冷凍胚胎的凍后活力。

3.1 常規慢速冷凍法

將卵母細胞或胚胎放入低濃度抗凍劑的冷凍保護液中，經過2 min平衡、誘發結冰8 min后，以0.3—0.5℃/min的速率緩慢降溫35℃，停留10 min后投入液氮中進行長期保存。從而使牛、羊胚胎細胞內形成玻璃化狀態，卵母細胞或胚胎得以長期保存。目前，常規慢速冷凍法為大多數動物及人類胚胎學家所廣泛接受。這種方法在國外已經實現了商業化應用，適合大量的冷凍胚胎，但其主要缺點是冷凍程序較繁瑣、費時，必須有昂貴的程序冷凍儀；而且冷凍牛、羊卵母細胞及體外胚胎時效果差。由于需要人工誘發結冰，然后以緩慢的降溫速率進行降溫，這種胚胎冷凍保存方法雖然可靠，但需要專業的胚胎冷凍儀設備，并且操作程序復雜，時間較長。且必須由專業技術人員操作，專用脫除抗凍劑的解凍液、體視顯微鏡和實驗室無菌條件，不利于在現場條件下進行操作。因此制約了牛、羊胚胎移植技術的推廣應用和胚胎生物技術的產業化進程。

3.2 玻璃化保存法

長時間以來，牛羊、胚胎玻璃化保存存在頗多爭議，研究證明，在各種冷凍方法中，牛、羊等哺乳動物胚胎玻璃化保存是一種有效、實用的方法。經過近20年研究，發明多種牛、羊體外胚胎玻璃化保存液（解凍液）和保存方法，效果明顯優于常規冷凍法，但一直難于走出實驗研究階段，使其真正在生產中得到商業化應用。玻璃化保存技術不需要昂貴的冷凍設備、操作程序簡單、省時，與傳統胚胎冷凍方法相比具有明顯優勢，有利于加速良種牛、羊的快速擴繁及品種改良進程，縮短世代間隔。

玻璃化冷凍前，胚胎在玻璃化液平衡過程中，環境溫度很重要。室內溫度高時，平衡時間短成活率高：溫度太低時，平衡時間短并不能使存活率升高。因為在玻璃化液中，乙二醇的滲透量起到關鍵作用。乙二醇的滲透量與環境溫度和平衡時間有關。室溫時、乙二醇進入細胞速度快，細胞膜通透性好，需要的平衡時間短。較高溫度下經過一個短時間處理是合適的，一般室溫為20℃或25℃。而在胚胎解凍過程中，環境的溫度同樣是很關鍵的因素之一。太高和太低對解凍胚胎的存活力都是不利的，不利于抗凍劑的脫出及胚胎的復水，室溫最好控制在30℃。

牛冷凍胚胎直接移植法可以避免胚胎解凍過程中，脫除冷凍劑過程所帶來的形態學檢查不精確、操作技術水平的誤差等問題，操作省時、簡便，不需要任何專門的設備，胚胎解凍直接移植。牛、羊胚胎冷凍后直接移植的方法能降低應用胚胎移植配套技術推廣的費用，提高妊娠率及產仔率，促進了牛、羊胚胎冷凍生產商業化進程，加速了品種改良。

4 冷凍保護劑

應用常規冷凍保存法，在羊胚胎冷凍的過程中，甘油作冷凍保護劑，胚胎放人甘油冷凍劑中與胚胎放人乙二醇冷凍劑中的形態變化行為是不同的。乙二醇分子量小，滲入胚胎內速度快，在顯微鏡下幾乎觀察不到胚胎形態的變化；甘油分子量較大，甘油滲入胚胎的速度慢，胚胎放入甘油冷凍劑中時，胚胎上浮，胚胎皺縮變小，嚴重脫水，隨著甘油的逐漸滲入，胚胎細胞內、外滲透壓達到平衡，胚胎才恢復原來的形狀，胚胎下沉至培養皿底。研究證明：牛、羊冷凍胚胎的移植受胎率，甘油和乙二醇作冷凍保護劑的受胎率并沒有顯著差異，甘油冷凍劑組的移植受胎率略好于乙二醇作冷凍保護劑組，二者作為胚胎冷凍保護劑均是可行的。羊胚胎冷凍，甘油作冷凍保護劑可以作為首選，因為羊的冷凍胚胎進行移植時，需要進行前裝管的處理過程；牛胚胎冷凍，可以首選乙二醇作冷凍保護劑，因為牛冷凍胚胎移植時，不需要重新裝管的前處理過程，而是可以采用直接移植法。

總之，在胚胎的冷凍、解凍過程中，探尋最佳的冷凍保護劑組合、解凍后一步法脫出冷凍保護劑或者直接移植法，保證胚胎凍后的存活力，提高冷凍胚胎移植受胎率和產仔率，建立簡便、快捷的胚胎冷凍解凍移植程序，加速推廣家畜良種化進程，胚胎移植配套技術為牛、羊良種化提供技術保障。