參苓白術(shù)散加味大黃保護腸黏膜屏障功能的實驗研究

廣 州 市 中 醫(yī) 院 外 科(510130) 田立新 張惠東 楊澤娟 閻圣玉廣州市天河區(qū)紅十字會醫(yī)院 吳春琳

本文研究參苓白術(shù)散加味大黃保護腸黏膜屏障功能的作用,為臨床上在嚴重創(chuàng)傷、嚴重感染、大手術(shù)后患者應用該方來調(diào)理腸功能、保護腸黏膜功能,減少并發(fā)癥的發(fā)生,提高療效提供前期依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 NIH小鼠,SPF級,45只,雄性,體重：25～30g。提供單位：廣東省醫(yī)學實驗動物中心。實驗動物質(zhì)量合格證明編號：0065784。識別方法：采用被毛染色法,使用飽和苦味酸對 NIH小鼠進行編號,在 NIH小鼠體表不同部位的被毛涂染斑點,以示不同號碼。以 NIH小鼠皮膚染色和籠具雙重編號標記識別。飼養(yǎng)管理：飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學實驗動物中心 SPF級動物房,實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2008-0002,2009年年檢合格。動物飼養(yǎng)條件：小鼠飼養(yǎng)于大塑料盒內(nèi),每盒 15只,飼養(yǎng)溫度 ：20℃ ～ 25℃,濕度 ：40% ～70%,采用 12小時晝夜間斷照明;自由進食、飲水。飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定,以保證試驗結(jié)果的可靠性。對購入小鼠檢疫3天,期間每日檢查小鼠 1次,未發(fā)現(xiàn)不健康的小鼠,全部健康小鼠進行實驗。

1.2 實驗藥品 供試品名稱：參苓白術(shù)散加味大黃。編號：TC10043。來源：廣州市中醫(yī)院中藥房,常溫。對照品名稱：瑞素;編號：MC10012;批號：80DC436;性狀：液體;來源：華瑞制藥有限公司;保存條件：2℃～8℃。

1.3 實驗用溶媒 純凈水。

1.4 主要實驗儀器與試劑 全自動酶標儀,ELX800,由美國 BIO-TEX生產(chǎn);電子分析天平,BS-3000A,由上海友聲衡器有限公司生產(chǎn);低速冷凍離心機,KDC-2046,由科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn);3℃～7℃醫(yī)用保存箱,SRM-CD471,由日本三洋生產(chǎn);-40℃醫(yī)用保存箱,MDF-U 5411,由日本三洋生產(chǎn)。主要試劑：小鼠Ⅱ型 A2。ELISA試劑盒：購自武漢華美生物工程有限公司,No.CSB-E08321m。小鼠 ELISA試劑盒：購自武漢華美生物工程有限公司,No.CSB-E11329m。

1.5 劑量設計與分組 設計依據(jù)：中藥藥效研究思路與方法;劑量設計與分組：將 45只小鼠按體重隨機分為正常對照組、瑞素組和參苓白術(shù)散加味大黃組(實驗組),每組 15只。

2 實驗方法

2.1 供試品和對照品配制方法 參苓白術(shù)散加味大黃 ：人參 7g、云苓 6g、白術(shù) 6g、蓮子肉 4g、山藥 4g、扁豆 4g、砂仁 4g、薏苡仁 4g、桔梗 4g、大黃 4g、甘草 3g。將上述配方 100g,放置于圓形燒瓶中,加入 100mL蒸餾水,100℃加熱 2小時后,用細紗布過濾,將其濾液在蒸發(fā)器中(50℃)定容至 1000m L(相當于 100g生藥/L),冷卻后裝入消毒玻璃瓶中備用。可重復多次制備供試驗用。瑞素：無需配制,現(xiàn)用現(xiàn)取。

2.2 給藥方法 實驗組小鼠每只灌服 0.5m L,瑞素組小鼠每只灌服瑞素溶液 0.5mL;正常對照組小鼠每只灌服生理鹽水 0.5mL,每 8小時 1次,共 3次,動物給藥后禁食。

2.3 動物取材 于實驗的第 24小時以頸椎脫臼法處死小鼠,取全部小腸稱重,量長度,并收集小腸灌洗液、勻漿液。收集方法：1)小腸灌洗液收集：小腸測完重量和長度后,用生理鹽水吸取漿膜上的血漬,然后用 10%乙酸 35mL灌洗小腸,分別收集小腸灌洗液,離心取上清液并裝入截留分子量為 3500的透析袋,在 4℃去離子水中透析 18小時濃縮后冷凍干燥稱重,密封保存于 -20℃冰箱中待用。2)小腸勻漿液制備：收集完灌洗液后,將小腸剪為 2mm長短,在 150mL 30%乙酸溶液中電動冰浴勻漿(4000r/min×10min),分離上清液和沉淀,收集上清液,將上清液裝入截留分子量為 3500的透析袋,在 4℃去離子水中透析 18小時濃縮后冷凍干燥稱重,密封保存于 -40℃冰箱待用,送廣州中醫(yī)藥大學進行冷凍干燥。

2.4 檢測指標 1)觀察：每次灌胃觀察小鼠的外觀體態(tài)(毛、色、形)及二便情況并作相應記錄,若有死亡動物應及時進行解剖,并觀察內(nèi)臟各器官形態(tài)變化。2)小腸重量、長度測定：動物處死后,立即剖腹切取從屈氏韌帶到回盲部(空腸和回腸),以 2把止血鉗分別夾住兩端切口,測量其重量(g)和長度(cm)。3)小腸灌洗液及小腸壁組織勻漿中 Lp-PLA2含量檢測：應用 ELISA試劑盒檢測。4)小腸灌洗液及小腸壁組織勻漿中 LZM含量檢測：應用ELISA試劑盒檢測。

2.5 統(tǒng)計分析 各組小鼠小腸重量、小腸長度、Lp-PLA2、LZM含量的數(shù)據(jù)均采用 (±s)表示,采用SPSS13.0方差分析進行各組間的差異性統(tǒng)計分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠日常情況觀察結(jié)果 給藥前后,各組小鼠均未見異常行為,精神良好,毛有光澤,活動自如,二便正常。

3.2 小鼠小腸重量、長度測定 實驗組、瑞素組小鼠的小腸重量及長度與正常對照組比較差異均無顯著性(P＞0.05)。見表 1。

表1 小鼠小腸重量、長度測定結(jié)果(±s)

表1 小鼠小腸重量、長度測定結(jié)果(±s)

n 小腸重量(g) 長度(cm)正常對照組 15 1.491±0.14 57.3±3.2參苓白術(shù)散加味大黃組 15 1.509±0.20 57.9±4.5瑞素組 15 1.533±0.13 58.3±3.7

3.3 小鼠小腸灌洗液 Lp-PLA2、LZM測定 實驗組小鼠的小腸灌洗液 Lp-PLA 2、LZM含量與正常對照組比較差異有非常顯著性(P＜0.01),與瑞素組小鼠比較差異有顯著性(P＜0.05)。瑞素組小鼠的小腸灌洗液 Lp-PLA2、LZM含量與正常對照組比較,差異有顯著性(P＜0.05)。見表 2。

表2 小鼠小腸灌洗液 Lp-PLA 2、LZM含量測定結(jié)果(±s)

表2 小鼠小腸灌洗液 Lp-PLA 2、LZM含量測定結(jié)果(±s)

注：與正常對照組比較,△P＜0.05和△△P＜0.01。

n 小腸灌洗液Lp-PLA 2(ng) LZM(ng)正常對照組 15 36.91±6.69 3.82±0.33參苓白術(shù)散加味大黃組 15 46.28±7.32△△ 4.73±0.70△△瑞素組 15 45.11±10.91△ 4.83±0.96△△

3.4 小鼠小腸勻漿液 Lp-PLA2、LZM含量測定 實驗組小鼠的小腸勻漿液 Lp-PLA2、LZM含量與正常對照組比較,差異無顯著性(P＞0.05);瑞素組小鼠的小腸勻漿液 Lp-PLA2、LZM含量與正常對照組比較,差異無顯著性(P＞0.05)。見表 3。

表3 小鼠小腸勻漿液 Lp-PLA 2、LZM含量測定結(jié)果(±s)

表3 小鼠小腸勻漿液 Lp-PLA 2、LZM含量測定結(jié)果(±s)

n 小腸勻漿液Lp-PLA 2(ng) LZM(ng)正常對照組 15 114.13±34.06 13.51±4.75參苓白術(shù)散加味大黃組 15 109.94±42.37 13.58±6.58瑞素組 15 130.68±32.68 16.30±6.37

4 結(jié) 論

腸黏膜屏障是阻止腸內(nèi)細菌移位到血液中引發(fā)繼發(fā)感染的重要屏障。因此,腸黏膜屏障功能健全時,人體不會出現(xiàn)繼發(fā)感染。當嚴重創(chuàng)傷、腹部大手術(shù)后,禁食時間較長,腸黏膜屏障功能受損,容易出現(xiàn)繼發(fā)感染而影響預后。因此,禁食時間超過 3天的患者臨床上都應重視保護腸黏膜屏障功能[1]。

查閱文獻 Lp-PLA2、LZM常用來檢測腸黏膜屏障功能[2-3]。在本試驗條件下,100g生藥/L劑量的參苓白術(shù)散加味大黃可以提高 NIH小鼠小腸灌洗液 Lp-PLA2、LZM含量,提示參苓白術(shù)散加味大黃可能具有促進小腸 Lp-PLA 2、LZM分泌的作用。臨床上在嚴重創(chuàng)傷、嚴重感染、大手術(shù)后患者可應用該方來調(diào)理腸功能、保護腸黏膜功能,減少并發(fā)癥的發(fā)生,提高療效。

[1] 黃建賢.大黃促進小鼠小腸溶菌酶分泌的實驗研究[J].中國醫(yī)師雜志,2005,(10)：1350

[2] 李玉 .大黃對小鼠腸黏膜屏障保護作用的機理探討[J].四川大學學報(醫(yī)學版),2005,(2)：210

[3] 胥楠.大黃對小鼠腸道免疫分泌物的影響[J].中國中藥雜志,2005,(18)：1441