水華藍藻細胞提取物對實驗鼠毒理效應研究進展

秦文弟，楊柳燕

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，江蘇 南京 210093

由于環境污染的日趨加劇及環境的惡化，使水體水華頻生，并造成嚴重的生態災難和健康危害［1］。世界衛生組織資料顯示，淡水中許多藻類，特別是藍藻，如微囊藻屬、魚腥藻屬、顫藻屬、念珠藻屬和節球藻屬中的某些種或株系等能產生藍藻毒素(主要為微囊藻毒素，microcystin，MC)［2］。藍藻毒素不僅能造成生物體急性和亞急性中毒，而且流行病學調查及相關試驗研究顯示，藍藻毒素還與多種消化道腫瘤，特別是肝癌的發病率升高相關而具有潛在致癌作用［3］，因此，有毒藻類引起的水體藍藻毒素污染已成為一個全球性的環境問題，而藍藻毒素健康危害性的研究已成為學術界研究、關注的熱點和難點。有人對比研究了主要產生生物堿類筒胞藻毒素(cylindrospermopsin)的藍藻Cylindrospermopsisraciborskii提取物和純的cylindrospermopsin，發現毒性類型和毒害程度都有所不同［4］，這引起許多學者假設藍藻中還有其他一些毒素。而目前的研究主要集中在純藻毒素的生態毒理學效應，對藍藻細胞提取物的研究相對較少。另外，對于水華藍藻細胞提取物的毒理學研究也主要集中于對水生生物的研究，而對哺乳動物的研究相對較少，筆者論述了水華藍藻細胞提取物對實驗鼠的毒理學效應，以期為合理、正確評價水華藍藻造成的危害及其健康風險評價提供依據。

1 水華藍藻細胞提取物對實驗鼠臟器細胞的凋亡效應

細胞增殖、分化、死亡是細胞經歷的基本過程。細胞凋亡是多細胞有機體為調控機體發育和維護內環境穩定而由基因控制的細胞主動死亡過程，是細胞內在的決定動物發育和組織平衡的重要機制，是維持生物正常生理過程和功能活動所必須的，細胞凋亡是多細胞生物生命活動過程中不可缺少的組成內容，貫穿于其全部生命周期［5］。但如果細胞過度凋亡則會引起一系列生理生化反應紊亂，進而引起機體受損，甚至導致動物死亡。研究表明，藍藻細胞提取物可引起多種細胞發生凋亡，其特征為細胞皺縮，染色質濃縮，磷酸酰絲氨酸外露，并形成凋亡小體［6］。由于肝臟存在能轉運水華藍藻細胞提取物的膽汁酸載體轉運系統(有機陰離子轉運系統)，因此水華藍藻細胞提取物具有極高的肝細胞選擇性和生物活性。如將實驗鼠通過腹腔或口服給藥暴露于水華藍藻細胞提取物后，迅速引起其急性中毒。解剖發現實驗鼠肝臟腫大、彌漫性出血甚至壞死;其中肝臟形態學顯示，藍藻細胞提取物導致肝臟肝索結構破壞，肝細胞間接觸降低;超微結構顯示為肝臟線粒體腫脹，橋粒張力絲喪失，微絲網重組［7］。施瑋等［8］研究了藍藻細胞提取物對大鼠肝細胞凋亡生態毒理效應的影響，結果表明，用含有 4，8，12 μg/(kg·d)MC的水華藍藻細胞提取物經腹腔注射染毒35 d后觀察到肝細胞增生活躍，并伴有凋亡或壞死樣表現;掃描電鏡顯示，染毒后的肝細胞變得不規則，呈空洞樣變，并有特征性的胞膜泡出現。陳華等［9］用750 g/kg濕藻腹腔注射顫藻粗提物染毒小鼠，結果表明，小鼠生長緩慢，肝臟腫大，肝臟系數增高。染毒 3周后，實驗組小鼠肝質量為(1.93±0.11)g，肝臟系數為6.11±0.20;對照組肝質量為(1.59±0.19)g，肝臟系數為 4.33±0.34，有顯著性差異(P＜0.05)。肝臟病理學檢查發現，肝細胞變形、凋亡，甚至壞死，小葉靜脈充血，并伴隨有炎性細胞浸潤。張志勇等［10］用含有10 μg/mL MC的藍藻提取物處理原代培養大鼠肝細胞，發現藍藻細胞提取物對原代培養大鼠肝細胞有明顯的毒作用，其主要作用方式是引起細胞凋亡。而凋亡的特征主要表現在:1)光學顯微鏡下，正常細胞個大、核圓且清晰，核色均勻，但經藍藻細胞提取物處理后，一些細胞收縮、變圓、變小，核變得模糊，且出現許多大大小小的胞膜泡;2)熒光顯微鏡下，正常細胞核大且圓，核質均勻，呈淡藍色，而經藍藻細胞提取物處理后，有的細胞染色質雖呈藍色，但收縮成條塊狀，分布于核的周邊，有的細胞核碎裂成小塊，細胞發生早期凋亡，還有的細胞核濃縮成致密球狀，并呈桔紅色，形成晚期凋亡細胞。據統計，凋亡細胞(包括早期和晚期)的百分比呈明顯的劑量和時間效應關系。研究表明，在含不可檢測水平的藻毒素的情況下，藍藻細胞提取液對實驗鼠有肝細胞凋亡毒性［11］。

細胞的凋亡受多種因子控制，同時凋亡也是基因活動引起級聯反應的結果，有多種因子和基因參與凋亡過程的起始和執行。水華藍藻細胞提取物引起肝細胞凋亡的機理主要認為是藍藻細胞提取物進入肝細胞后，能強烈抑制蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性，導致細胞內多種蛋白質過磷酸化，因而打破了細胞內蛋白磷酸化/脫磷酸化平衡，造成細胞內一系列生理生化反應紊亂，導致胞質中微絲網重排，細胞結構與穩定性破壞，進而引起肝細胞變形，甚至導致其凋亡和壞死［12］。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中起重要作用，是調節細胞凋亡的關鍵元件。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族，前者抑制凋亡，后者促進凋亡［13］。有試驗表明［6］，藍藻細胞提取物同時誘導了Bcl-2表達下降和Bax表達升高。Bcl-2表達下降表明細胞對水華藍藻細胞提取物的抗凋亡作用下降，而Bax表達升高說明其促凋亡作用加強，這些結果表明Bcl-2和Bax在水華藍藻細胞提取物導致的細胞凋亡中起重要作用，同時也部分解釋了藍藻細胞提取物誘導細胞凋亡的機理。另外，p53基因，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3級聯反應都被認為在水華藍藻細胞提取物致細胞凋亡過程中起著重要的調控作用［14-15］。研究表明，BRL-3A細胞暴露于10 nmol/L MC-LR的藍藻細胞提取物1 h后即可誘導p53蛋白表達升高，這充分說明p53蛋白在藍藻細胞提取物誘導的細胞凋亡過程中起著重要作用［14］。現在一般研究認為，藍藻細胞提取物主要通過線粒體途徑和氧化應激途徑引起細胞凋亡［16］。

2 水華藍藻細胞提取物對實驗鼠抗氧化防御系統的毒性效應

活性氧(ROS)是一組主要包括超氧陰離子(O2-)、羥基自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)等在內的自由氧基團，其主要來源于線粒體的電子傳遞鏈，在外源毒物的致毒機制中起著重要作用。正常情況下，電子傳遞鏈可以使代謝物脫下的成對氫原子通過多種酶和輔酶所催化的連鎖反應逐步傳遞，最終與氧結合成水，而毒物則通過破壞線粒體電子傳遞鏈的功能，使游離的氫增多，從而增加細胞內ROS水平。大量ROS的產生可引起脂質過氧化(LPO)，進而破壞細胞膜結構與功能，最終導致細胞崩解甚至死亡［17］。許多體內外試驗均證實，藍藻細胞提取物能引起大量ROS在實驗鼠肝細胞內生成，并進而對肝臟產生毒性而發揮其致毒作用［10，18］。丙二醛(MDA)常被作為衡量LPO的標準，研究發現，MDA水平在藍藻細胞提取物染毒的大鼠肝腎內明顯上升，同時所有抗氧化酶活力均有所下降，也表明了氧化應激在藍藻細胞提取物引起的細胞毒性中發揮著重要作用［19］。

2.1 對臟器抗氧化酶活性的影響

各種抗氧化酶主要包括谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GR)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等。研究發現，大鼠肝、腎的抗氧化酶活性在大鼠急性暴露于藍藻細胞提取物后都發生了改變，如以劑量為100和150 mg/kg的MC-LR的藍藻細胞提取物作用于大鼠24 h，48 h和14 d后，大鼠肝和腎內 GSH-Px，GR，SOD，CAT的活力都顯著降低，同時，肝和腎內LPO水平明顯上升［9］。這表明藍藻細胞提取物有可能通過影響臟器各抗氧化酶的活力，導致ROS積累，從而造成氧化損傷而發揮其致毒作用。

2.2 對谷胱甘肽(GSH)含量和表達的影響

GSH含量在維持正常細胞內氧化還原平衡過程中起著重要作用，它可以保護細胞免受氧化應激損傷。正常情況下，GSH在一定細胞或組織中含量相對穩定，但是某些外來污染物或其代謝物可與其結合而引起其耗竭和表達，因此在這些毒物存在的情況下，會引起GSH消耗。研究發現，藍藻細胞提取物在不會造成細胞形態學改變的濃度下(2和10 ng/mL)作用于大鼠肝實質細胞，3 h后可使肝細胞內的GSH水平顯著升高，而致使細胞產生氧化應激并可能導致細胞損傷。另外，藍藻細胞提取物介導的DNA損傷與GSH水平有著緊密的關聯，例如，當肝細胞內GSH水平下降時，發現藍藻細胞提取物引起的DNA損傷也隨之不斷增加;而當GSH水平恢復正常或超過正常水平時，則并沒有新的DNA損傷產生，而且即使是已經發生的損傷這時也都被修復了［20］。

2.3 對熱激蛋白(Heat Shock Proein，HSP)70表達的影響

HSP是機體在應激狀況下合成的一組高度保守的蛋白，對應激損傷具有一定的保護作用，也是細胞對各種早期應激反應的標志蛋白。HSP的產生主要原因為細胞內氧化還原狀態的不穩定，通常它的產生也是氧化應激早期的一個標志。包括微囊藻毒素在內的許多化學物質都可以引起HSP產生。其中HSP70是最重要、氧化應激后表達量最高的HSP家族，同時其也是研究最為廣泛的HSP家族蛋白之一。在多種應激狀態下，HSP70迅速表達。研究表明［21］，93.0 μg/kg的藍藻水華粗提物處理后小鼠肝臟的HSP70表達上升。研究還發現，含有半致死劑量(50.0 μg/kg)的MC-LR的藍藻細胞提取物作用于小鼠后，可以使小鼠的HSP70蛋白量顯著升高。同時，在蛋白質組學研究中發現，在藍藻細胞提取物作用后細胞內的HSP70表達都有不同程度的上調。這些結果表明，在受到水華藍藻細胞提取物脅迫時，HSP70表達上調可能主要是由于藍藻細胞提取物對細胞造成的氧化損傷，致使細胞產生氧化應激而使其HSP70含量增多，同時，可為細胞受到藍藻細胞提取物的脅迫而產生的氧化應激起到及時的指示作用。研究還表明，升高的HSP70可以提高細胞內抗氧化物的穩定性，從而增強細胞抗氧化損傷的能力，所以HSP70的上升同時又是細胞的一種自身防御機制。

3 水華藍藻細胞提取物對實驗鼠的遺傳毒性效應

研究表明，水華藍藻細胞提取物具有一定的遺傳毒性［22］。Ding等［23］通過小鼠骨髓嗜染紅細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗，對太湖水華藍藻細胞提取物的遺傳毒性進行了研究，結果顯示，1.25～125 μg/mL(以凍干藻細胞計)的太湖藍藻細胞提取物作用4 h，不僅能在染色體水平上影響細胞分裂增殖，還可直接作用于DNA分子并引起DNA分子移碼型突變而產生遺傳毒性，且其毒性有顯著的劑量-效應關系。Bu等［24］研究了沸水浴提取的銅綠微囊藻毒素對昆明小鼠的胚胎毒性效應，表明3.3 μg/kg MC-LR的微囊藻毒素粗提物不僅可減緩妊娠小鼠的生長，還可能引起其死亡和妊娠終止。處理組和對照組胎鼠體重、體長和尾長均有顯著差異，并由此得出結論:藍藻細胞提取物對小鼠孕期中和胚胎都有毒性效應。Senogles-Derham等［25］研究了含有cylindrospermopsin的粗提物對孕期大鼠的致畸性，發現該粗提物能使大鼠早產，且生產的幼鼠體重顯著下降，胃腸道有血腫發生。有研究表明［26］，藍藻細胞提取物對大鼠生殖系統有嚴重損傷，使大鼠精子質量下降，并影響到后代。

4 水華藍藻細胞提取物對實驗鼠的促癌或致癌作用

隨著水體富營養化加劇而導致藍藻水華暴發，藍藻水華暴發產生的主要問題之一就是藻類所引起的水污染問題，其已越來越受到人們關注，其中飲用水藻類肝毒素污染，特別是藻毒素的促癌或致癌作用問題備受各國重視［27］。有資料表明，飲用水中的藻類肝毒素污染可能是除肝炎病毒和黃曲霉毒素以外導致肝癌的第3個重要原因［28］。我國江蘇啟東和海門地區的流行病學調查研究顯示，藍藻細胞提取物中的微囊藻毒素與當地的肝癌高發率呈一定的正相關關系［29］。藍藻細胞提取物的促癌或致癌作用主要是以微囊藻毒素的研究作為重點，研究也認為微囊藻毒素主要通過使肝細胞過度增殖以致癌變，其機理最主要的是微囊藻毒素能抑制PP1和PP2A活性。PP1和PP2A主要催化絲氨酸/蘇氨酸蛋白去磷酸化，例如通過對促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的去磷酸化，對MAPK途徑起負調控作用，而MAPK通路在癌癥的發病機理中起著重要作用。微囊藻毒素能與PP1和PP2A的催化亞基結合，抑制其活性，導致MAPK過度激活，使調控細胞增殖與凋亡的基因平衡失調，細胞生長失控而導致癌變［6］。另外，細胞過度增殖也是其癌變的主要原因之一。研究發現微囊藻毒素能通過誘導細胞增殖而致使其癌變。c-fos，c-jun是一類控制細胞增殖的早期反應基因。微囊藻毒素能誘導肝細胞內MAPK磷酸化水平升高而激活c-fos，c-jun等表達，推動肝細胞進入細胞周期，使肝細胞無限增殖而導致癌變［30］。其次，原癌基因和抑癌基因的平衡失調，也是導致細胞過度增生而發生癌變的誘因之一。研究發現微囊藻毒素能調節與細胞增殖相關的原癌基因和抑癌基因的表達。例如，微囊藻毒素可上調肝細胞中原癌基因細胞核增殖抗原(PCNA)表達，而抑制抑癌基因P21WAF1的表達，進而使病變細胞的細胞周期失控，無限制的增生而導致癌變［31］。胡志堅等［14］研究表明，p53基因也在藍藻細胞提取物促癌過程中起著重要的作用。長期、低濃度的MC暴露最大的潛在危害是提高相關人群的癌癥發病率，例如國內外大量的動物試驗和流行病學資料表明，長期飲用低濃度MC污染的水與原發性肝癌、大腸癌和胃腸道腫瘤等疾病的高發率有關［29-30］。

5 水華藍藻細胞提取物與單純藍藻毒素的毒理學效應比較

研究表明，水華藍藻細胞提取物的毒理學效應與單純的微囊藻毒素的毒理學效應有很大不同，一般認為，藍藻細胞提取物的毒理學效應要大于純微囊藻毒素的毒理學效應。如 Keil等［32］發現藍藻Planktothrix agardhii NIVA 34的細胞水提取物(LC50為0.08 mg/mL)盡管不含有任何微囊藻毒素但與含有微囊藻毒素的藍藻Planktothrix的細胞粗提取物(LC50為0.46 mg/mL)相比卻有更高的毒性，且其毒性與其所用的提取溶劑有很大關系。Majstereka等［33］研究表明，藍藻細胞提取物對線粒體有更大的毒性，如含有1 nmol/L微囊藻毒素的藍藻細胞提取物就能使細胞色素C氧化酶活性降低，而1 μmol/L的純微囊藻毒素才能使細胞色素C氧化酶活性降低。水華藍藻細胞提取物促癌或致癌的作用也是學術界研究的熱點和難點，目前的研究一般認為藍藻細胞提取物具有一定的致癌作用，而單純的微囊藻毒素則主要是促癌作用。如施瑋等［8］研究了純微囊藻毒素、藻類提取物和藻細胞裂解液致突變性，結果顯示，3種純毒素全部表現為陰性，即純藻毒素不能夠造成大鼠原代肝細胞DNA損傷。藻類提取物和藻細胞裂解液卻能使程序外DNA合成增加而具有一定的致突變性。趙金明等［28］研究表明，微囊藻毒素單獨作用不能誘導谷胱甘肽硫轉移酶(GSTPi，反映肝細胞癌前病變的生物標志物)mRNA及蛋白表達，微囊藻毒素單獨作用也不能使實驗組動物肝臟產生結節性增生灶，但能夠促進二乙基亞硝胺(DEN)產生更多結節性增生灶并誘導GSTPi mRNA和蛋白表達，且具有一定的劑量-效應關系，而DEN也是在藍藻水華暴發后產生的污染物之一。另外，常規飲用水處理技術對水體中微囊藻毒素的消除也并不是很徹底，而且水體在氯化消毒過程中還會形成大量的氯化消毒副產物。研究表明［34］，飲水中氯化消毒副產物與微囊藻毒素共存時，存在二者協同促癌的可能性。另外在用原代培養的鼠肝細胞評價水華藍藻細胞提取物毒性時發現，藍藻細胞提取物可以直接進入原代培養的鼠肝細胞，單純的藻毒素則不能直接進入原代肝細胞而導致毒性，這可能是由于藍藻細胞提取物中存在著協助微囊藻毒素進入原代肝細胞內的物質，而且這些物質與純藻毒素往往也有一些協同作用，因此藍藻細胞提取物的毒性要遠大于純藻毒素的毒性［35］。

6 結語

水華藍藻細胞提取物對實驗鼠具有較大的毒理學效應，而作為具有潛在促癌或致癌活性的污染物，藍藻細胞提取物對生物有機體具有較大的健康危害性和風險性，有必要對其進行更為深入的研究。同時，水華藍藻細胞提取物還有一定的免疫毒性［36］，在生殖器官［26］和長期生活于藍藻暴發區的漁民血液中都能檢測到［37］，表明對水華藍藻細胞提取物的毒理學效應及其健康風險評估還需進一步深入研究。

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