納米銀毒理學研究進展

鄧芙蓉，魏紅英，郭新彪

北京大學公共衛(wèi)生學院，北京 100191

納米材料是指在三維尺度上至少有一維尺度小于100 nm的物質。納米級粒徑使這些物質具有與大顆粒不同的理化特性，其具有更大的比表面積，具備更大的反應活性。納米銀是以納米技術為基礎研制而成的新型納米材料，因其優(yōu)越的抗菌性能，被廣泛用于醫(yī)療、食品、紡織、水質凈化等領域［1-2］。日益增加的納米銀的使用逐漸引起大家對其造成的環(huán)境危害的重視。最近一項研究揭示，銀在洗涮過程中很容易滲漏到廢水當中，從而破壞廢水處理廠處理廢水所用的有用細菌，還可對湖泊或河流中的水生生物造成威脅［3］。納米銀抗菌洗衣機的使用，使含有納米銀顆粒的洗衣廢水排入水環(huán)境，造成對水環(huán)境的污染［4］。此外，有研究表明，納米銀的抗菌性能會影響土壤中的有益菌，從而降低土壤的使用價值［5］。相對而言，目前有關納米銀對健康的影響及其機制的研究還較為局限，納米銀的毒性及其機制的研究還處于初步探索階段，有關納米銀使用的安全性還有待進一步探討。因此，深入探討納米銀的毒性作用及其機制，對于納米銀的安全使用和開發(fā)利用有著非常重要的理論和現(xiàn)實意義。

1 納米銀的體內試驗研究

動物試驗中納米銀的暴露方式有吸入、灌胃、氣管滴注、皮下注射或靜脈注射等，以上途徑的納米銀暴露可對動物的呼吸、皮膚、消化、免疫以及生殖系統(tǒng)等產生影響。

1.1 呼吸系統(tǒng)毒性

Sung等給大鼠連續(xù)吸入粒徑為18～19 nm的銀顆粒90 d后，大鼠出現(xiàn)肺功能下降，肺組織有不同程度的炎性細胞浸潤、肺泡壁增厚以及小的肉芽腫樣病變［6-7］。另有研究采用同樣的納米銀顆粒和吸入染毒方式，使大鼠連續(xù)暴露納米銀28 d，未觀察到任何組織病理學改變和血清生化指標改變［8］，該研究使用的納米銀濃度低于Sung的研究，提示納米銀的暴露時間和濃度可能是決定其毒性大小的關鍵因素。Hyun等采用納米銀(13～15 nm)對大鼠進行重復鼻黏膜染毒，28 d后發(fā)現(xiàn)中高劑量組大鼠含有黏液素的杯氏細胞體積和數(shù)目顯著增加，黏液素中硫黏蛋白有輕微的升高，而唾液黏蛋白沒有變化。該研究盡管觀察到了納米銀對黏膜黏液素的影響，但這并不足以說明其具有毒性效應。鑒于黏液素在人體呼吸系統(tǒng)健康及宿主抵抗力中的重要作用，因此有待更多的研究進一步證實［9］。還有研究表明靜脈注射膠體銀顆粒，引起大鼠發(fā)生肺水腫而死亡［10］。

1.2 對皮膚的影響

納米銀顆粒在紡織品和傷口敷料中的廣泛應用使納米銀可直接與皮膚相接觸。有研究表明，皮膚涂抹1%納米銀膏體制劑可有效抑制BALB/c小鼠皮炎的發(fā)生，具體表現(xiàn)為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-12(IL-12)分泌被抑制，同時觀察到了炎性細胞的凋亡［11］。Bhol等在豚鼠試驗中也觀察到同樣的抗炎效應［12］。這些數(shù)據(jù)提示，納米銀在抑制炎癥方面有積極作用，可用于治療免疫性疾病或炎性疾病［13］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，納米銀可引起大鼠肺泡巨噬細胞中TNF-α，IL-1β和巨噬細胞炎癥蛋白的升高，納米銀經呼吸攝入或消化道攝入可分別導致大鼠肺臟和小鼠肝臟炎癥的發(fā)生［6-7］。因此，納米銀對不同組織中炎性因子的調節(jié)作用可能有所不同，有關納米銀對細胞炎性因子分泌的調節(jié)作用還有待進一步的研究。此外，在以豬為動物模型的一項研究顯示，納米銀可明顯促進皮膚傷口的愈合［14］。但Supp等將含有納米銀的皮膚替代品嫁接于裸鼠，沒有觀察到任何促進或抑制傷口愈合的作用［15］。這些結果提示納米銀對皮膚可能具有雙重作用，因此，有關納米銀對皮膚的影響及其機制還需要深入研究。

1.3 生殖毒性

有關納米銀顆粒的生殖毒性，目前僅局限于少數(shù)對魚類的體內試驗和一些體外試驗研究。Bar-Ilan等將透明斑馬魚胚胎暴露于不同粒徑(3，10，50和100 nm)的膠體銀，銀顆粒(100和250μmol/L)暴露120 h可導致斑馬魚胚胎100%死亡，相同時間的金顆粒暴露只引起不到3%的死亡率;進一步研究發(fā)現(xiàn)銀顆粒可導致多種胚胎形態(tài)異常，該研究表明，納米銀可被胚胎攝入，銀的毒性可能是由其自身產生的，也可能是由其進入胚胎體內后產生的銀離子而導致的［16］。上述研究發(fā)現(xiàn)，在所有粒徑的納米銀和納米金中，銀的毒性較大;當作用時間和濃度一定時，銀顆粒的毒性與其粒徑有關，說明納米材料的毒性與其化學性質密切相關。體外試驗也表明納米銀可能具有生殖毒性，Bradyich-Stolle等發(fā)現(xiàn)同劑量同時間下納米銀(15 nm)對小鼠精子干細胞株的生殖毒性大于納米鋁(30 nm)和納米三氧化二鉬(30 nm)［17］。

1.4 肝臟毒性

納米銀或銀離子經口服或呼吸暴露后可能進入到血液循環(huán)系統(tǒng)，到達體內多個臟器，導致相應器官的損害，其中有關肝臟損害的報道較多。Takenaka等給大鼠吸入納米銀(4～10 nm)后發(fā)現(xiàn)，雌雄大鼠的肝細胞中均出現(xiàn)空泡變性，高劑量組出現(xiàn)散在肝壞死灶，雌性大鼠還表現(xiàn)出明顯的劑量反應關系［18］。Kim等對大鼠連續(xù)灌胃納米銀顆粒(60 nm)28 d，發(fā)現(xiàn)腦、肝、腎、肺及睪丸中有明顯的納米銀蓄積，其中肝毒性表現(xiàn)最為明顯。但需要指出的是，該研究中所使用的染毒劑量特別是高劑量組的濃度太高〔低、中和高劑量組分別為 30，300，1000 mg/(kg·d)〕，使其科學價值有所降低［19］。因此，在進行試驗設計時，一定要考慮人體暴露的實際濃度，使試驗結果更接近于真實。Cha等采用灌胃的方式分別給予小鼠2.5 mg的納米銀(15 nm)和微米銀(2～3.5μm)，3 d后納米銀暴露組肝組織出現(xiàn)明顯的炎癥反應，進一步發(fā)現(xiàn)4種與炎癥有關的基因表達量發(fā)生改變，從而證實了納米銀經消化道攝入對肝臟的炎癥損害［20］。

1.5 其他毒性

除以上所討論的納米銀的毒性效應之外，有文獻報道納米銀還可對動物的腎臟和腦組織產生影響。Kim等用納米銀顆粒(60 nm)對大鼠連續(xù)灌胃28 d后，腎組織中可出現(xiàn)納米銀劑量依賴性的蓄積［19］。Rahman等對成年雄性小鼠腹腔注射25 nm的納米銀顆粒(100，500和1000 mg/kg)，24 h后發(fā)現(xiàn)小鼠腦部尾狀核、前皮質層和海馬組織都發(fā)生了基因表達的改變。認為納米銀可通過誘導氧化應激，引起基因表達改變，導致凋亡發(fā)生，從而引起神經系統(tǒng)損傷［21］。該研究采用靜脈注射的染毒方式評價納米銀的神經毒性，較為罕見，同時其采用的劑量也較高。

有關納米銀吸入后在免疫細胞中的分布情況至今鮮見報道。但Takenaka等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠吸入納米銀后在脾臟中觀察到納米銀的存在［18］，靜脈注射(LD50，67 mg/kg)或經口給予高濃度的膠體銀可引起大鼠死亡，病理解剖發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟、脾臟和腎臟均出現(xiàn)褐色斑點，提示靜脈注射或經消化道的納米銀暴露可對脾臟產生損害［10］。

2 納米銀的細胞毒性及其機制研究

多數(shù)動物試驗研究揭示了納米銀在體內的分布、蓄積，也有研究探討了納米銀的毒性，但大部分體內試驗對于毒性終點的觀察是以一般病理學檢查和生化指標測定為主，對于納米銀的毒作用機制未能給出更多的解釋。近年來，一些研究者對不同表征的納米銀進行了體外毒性及其機制的研究。多數(shù)研究認為，與其他表征(主要是粒徑)相似的納米材料相比，納米銀的毒性較強;納米銀的毒性效應與其粒徑和表面修飾密切相關，對于不同的細胞類型其毒性效應也有所差異［22-25］。納米銀的細胞毒性主要表現(xiàn)為降低細胞存活率、損傷細胞膜、誘導氧化應激、影響炎性因子的分泌、影響細胞間隙連接通訊改變、引起DNA損傷以及誘發(fā)細胞凋亡等。

2.1 納米銀誘導細胞氧化應激和凋亡的發(fā)生

研究表明，納米銀暴露可引起細胞產生氧化應激，并由此產生相應的細胞毒性。10～50μg/mL的納米銀(15和100 nm)即可引起大鼠肝細胞株BRL3A細胞胞內活性氧(ROS)顯著增加和谷胱甘肽(GSH)明顯下降，同時線粒體膜電位下降和細胞存活率降低，并存在明顯的劑量反應關系［24］。此外，納米銀還可引起正常人肺成纖維細胞和人神經膠質瘤細胞胞內活性氧增加和線粒體內三磷酸腺苷(ATP)減少，細胞DNA損傷和細胞G2/M期阻滯，提示納米銀通過引起線粒體呼吸鏈損傷導致活性氧產生和ATP合成受阻，二者繼而引起DNA損傷和細胞周期阻滯［23］。另有研究比較了納米銀(＜100 nm)和微米銀(250μm)對小鼠成纖維細胞NIH3T3，大鼠血管平滑肌細胞A10以及HCT116人克隆癌細胞的毒性，發(fā)現(xiàn)納米銀可使胞內ROS升高，并可引起明顯的細胞凋亡，用N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理細胞可明顯減少細胞凋亡的發(fā)生，說明在納米銀的細胞毒性作用中有活性氧的參與［22］。一些研究報道，不同粒徑的納米銀誘發(fā)細胞凋亡可能與其誘導細胞產生氧化應激有關［22，24，26］。Hsina等發(fā)現(xiàn)納米銀可引起細胞線粒體細胞色素C向胞漿釋放，同時Bax由胞漿向線粒體內轉移，進一步研究發(fā)現(xiàn)納米銀暴露6 h即可引起細胞JNK，p53的磷酸化以及DNA修復酶PARP的裂解，采用NAC或JNK抑制劑(SP600125)可有效抑制JNK激酶和p53的活化，細胞凋亡率顯著降低，提示納米銀可能通過誘導細胞內氧化應激而激活JNK通路，從而誘發(fā)細胞凋亡［22］。

納米銀誘導的細胞凋亡作用也與細胞類型和納米銀的表面修飾有關。Bhol等發(fā)現(xiàn)1%的納米銀膏體制劑(50 nm)可引起炎性細胞凋亡，但對皮膚角阮細胞無明顯效應，提示對于不同的細胞類型納米銀的作用特征可能有所不同［11］。還有研究比較了不同表面修飾的納米銀(25 nm)的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)修飾(多聚糖包被)與未修飾的納米銀均可引起細胞凋亡的發(fā)生，而前者還可引起明顯的細胞DNA損傷，推測經表面修飾的納米銀可能通過DNA損傷而引發(fā)細胞凋亡，未經表面修飾的納米銀可能通過其他途徑而誘發(fā)細胞凋亡。

2.2 納米銀對細胞的遺傳毒性

國內有學者比較了納米銀和微米銀對HL-7702肝細胞DNA的損傷作用，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，納米銀可引起肝細胞DNA的明顯損傷，隨著納米銀濃度的升高，其對細胞DNA的損傷作用也隨之增強，表現(xiàn)出明顯的劑量反應關系。但在同樣的試驗條件下，未觀察到微米銀對肝細胞DNA的損傷作用［27］。Hackenberg等研究也發(fā)現(xiàn)，0.01 μg/mL 的納米銀在作用1 h后即可引起人間質干細胞DNA損傷，隨著染毒濃度(0.1，1和10μg/mL)的增加和染毒時間(3和24 h)的延長，納米銀對細胞DNA的損傷作用也顯著增強［28］。以上2項研究均提示，納米銀具有一定的遺傳毒性，其主要毒性表現(xiàn)為可造成細胞DNA損傷。然而，還有研究發(fā)現(xiàn)，納米銀單獨作用的遺傳毒性很弱，但當納米銀與溴化十六烷基吡啶共同存在時，即可表現(xiàn)出明顯的遺傳毒性［29］。因此，有關納米銀的細胞遺傳毒性及其機制還有待進一步研究。

2.3 納米銀對細胞間隙連接通訊的影響

細胞間隙連接通訊(gap junctional intercellular communication，GJIC)是哺乳動物細胞間普遍存在的一種細胞間通訊，存在于除血液細胞和骨骼肌細胞以外的所有細胞和組織中。GJIC是相鄰細胞之間形成的一種能夠開放和關閉的親水性膜通道結構，間隙連接間信息傳遞可協(xié)調不同細胞和組織的代謝或電傳導性，在組織內環(huán)境穩(wěn)定，細胞生長、增殖和分化及生長控制中起著重要的調控作用，對于維持多細胞生物的組織和器官間的平衡非常重要。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，在未引起明顯細胞毒性的濃度范圍內，納米銀〔(69±3)nm〕可通過上調間隙連接蛋白Cx43而明顯促進人肺上皮細胞GJIC，而銀離子卻未能觀察到此作用。為了更進一步揭示納米銀和銀離子對細胞GJIC的影響機制，研究探討了納米銀和銀離子對細胞間隙連接蛋白Cx43 mRNA表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)，納米銀和銀離子在作用24 h后，均可引起細胞Cx43 mRNA表達的增強［30］。該結果提示，影響GJIC功能可能是納米銀發(fā)揮其生物學效應的一個較早期的作用。該研究揭示了納米銀對GJIC的影響，并比較了其與銀離子的不同，研究結果為進一步揭示納米銀的生物安全性提供了新的研究方向。

3 小結與展望

納米銀對人體健康具有潛在的危害，很明顯，納米銀顆粒的毒性與其內部特性及氧化狀態(tài)有關，最終導致炎癥、細胞毒性以及遺傳毒性等的發(fā)生。然而，人們對生活中廣泛應用的納米銀的粒徑、形式以及聚集方式仍不很清楚，毒理學評價證據(jù)不足，有關納米銀的毒代動力學，也只有少數(shù)動物試驗和病例報道的資料。在迄今為止的有關納米銀的毒性研究中，納米銀的組成成分差別很大，有關納米銀的描述和研究使用的納米銀的粒徑也不盡相同，暴露途徑也各有差異，因此很難在一起進行比較并最終形成一個定論。今后對于納米銀的研究，筆者認為以下問題值得重視:

(1)納米銀研究設計過程中的暴露和劑量的問題。有關納米銀的暴露問題，包括顆粒物的濃度、暴露持續(xù)時間以及所使用的模型，以往個別研究中的高濃度使得結果在外推時受到限制。

(2)納米銀和銀離子的作用問題。可以看出，以上所述的研究大都沒有探究組織中蓄積的銀是以顆粒狀態(tài)存在還是以離子狀態(tài)存在，有關銀離子在納米銀的生物學效應中扮演怎樣的角色，納米銀對組織或細胞產生毒性的原因是由于納米銀的直接作用所致還是納米銀與細胞接觸之后釋放出銀離子，繼而由銀離子對細胞產生毒性，還是二者兼而有之，目前尚無清晰的結論。

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