CRE-decoy ODN對大鼠嗎啡戒斷癥狀的抑制作用

李華 王麗 秦星 蘇彥君 郝存勛

有研究認為，阿片和其他成癮藥物具有共同的細胞和解剖通路，而受體后細胞、突觸和神經網絡的適應性改變是成癮性形成的關鍵［1］。阿片類藥物與其受體結合后，通過升高細胞內cAMP［2－4］和游離 Ca2+濃度 (intracellular free Ca2+concentra-tion，［Ca2+］i)［5，6］，分別激活 cAMP 依賴的蛋白激酶 A(cAMP-dependent protein kinase A，PKA)［2－4］及鈣調蛋白依賴蛋白激酶(calmodulin-dependent kinase，CaMK)［7－9］，使轉錄因子 cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的Ser-133磷酸化，而持續調節其下游基因表達，參與神經元與突觸的可塑性與適應性［2－4，7－10］。本研究在體外觀察CRE-decoy ODN可選擇性下調慢性嗎啡誘導SK-N-SH細胞的CREB的DNA的結合活性、nNOS及fosB基因表達上調的基礎上，進一步在體觀察CRE-decoy ODN對嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的影響，為探尋阿片類物質依賴的干預措施提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器:可調定量移液器(2～1 000 μl)購自法國Gilson公司;微量注射器購自上海醫用器材廠;S2-93自動雙重純水蒸餾器購自上海強申生化儀器廠;江灣I-C型腦立體定位儀購自第二軍醫大學生理學教研室。

1．1．2 試劑及用品:鹽酸嗎啡購自沈陽第一制藥廠;鹽酸納絡酮購自美國Sigma公司;多聚甲醛、Na2HPO4、NaH2PO4購自北京化學試劑廠;全硫代磷酸化CRE-decoy ODN(5’-TGACGTCA TGACGTCA TGACGTCA-3’)由上海Sangon公司合成。

1．1．3 實驗動物:雄性Wistar大鼠(清潔級)40只，體重200～240 g，購自河北醫科大學實驗動物部。

1．2 方法

1．2．1 動物分組:40只Wistar大鼠在動物實驗室適應飼養3 d后，隨機分為5組，即0．9%氯化鈉溶液對照組，側腦室0．9%氯化鈉溶液注射對照組，嗎啡依賴組，嗎啡戒斷組，嗎啡戒斷CRE-decoy ODN治療組，每組8只。分籠飼養，每籠5只。實驗室通風良好，飼養溫度(24±1)℃，相對濕度50%，黑/白照明周期為12/12 h。大鼠自由飲水、進食，保持墊料干燥。飼料中蛋白含量為20%，膽固醇含量為3．5%。

1．2．2 動物模型制備:采用遞增劑量皮下注射建立大鼠嗎啡身體依賴模型。方案為:第1天皮下注射鹽酸嗎啡10 mg/kg，2次/d。嗎啡用量每日遞增10 mg/kg，連續5 d。第6天皮下注射嗎啡50 mg/kg，2 h后腹腔注射鹽酸納絡酮5 mg/kg進行催癮實驗。0．9%氯化鈉溶液對照組和側腦室0．9%氯化鈉溶液注射對照組大鼠注射等體積0．9%氯化鈉溶液。

1．2．3 大鼠側腦室微量注射:嗎啡戒斷治療組在末次注射嗎啡前30 h，對每只大鼠左側側腦室內注射溶解在10 μl saline 0．9%氯化鈉溶液中的CRE-decoy ODN 20 μg。在相應的時間點，對側腦室0．9%氯化鈉溶液注射對照組、嗎啡依賴組、嗎啡戒斷組每只大鼠則于左側側腦室內注射等體積0．9%氯化鈉溶液。左側側腦室注射的具體操作過程如下:大鼠在0．4%戊巴比妥鈉(40 mg/kg，側腦室內注射)麻醉下，根據文獻［11］，借助腦立體定位儀行左側側腦室注射。注藥點:前鹵后0．8 mm，中線旁 1．8 mm，硬膜下 3．7 mm。注射體積 10 μl，20 s 完成注射后，縫合皮膚。

1．2．4 嗎啡戒斷大鼠的行為學評定

1．2．4．1 對計數和觀察癥狀評分:在納絡酮催癮之前1 h，把0．9%氯化鈉溶液對照組及行左側側腦室注射術后活動正常的大鼠單獨放進一個直徑30 cm、高50 cm觀測筒內，使大鼠適應檢測環境。腹腔注射納絡酮后，不知情的觀測者隨即觀測大鼠的戒斷行為，并進行評分。需連續觀察1 h。①需觀測的戒斷癥狀包括兩類，即計數癥狀和觀察癥狀。計數癥狀需記錄濕狗樣抖動、牙齒顫抖、吞咽和跳躍的發生次數，再對其進行評分。評分標準為:0=不發作，1=發作1～5次，2=發作6～10次，3=發作≥11次。每15分鐘為一時間段，連續觀測1 h內上述行為的發生頻率，最后計算戒斷0～60 min的總評分。②需觀測6種觀察癥狀在戒斷0～60 min的出現程度，即上瞼下垂、流淚、流涎、豎毛、激惹(irritability)和腹瀉(diarrhea)，最后對其進行評分。評分標準為:0=未出現，1=輕度，2=中度，3=明顯。

1．2．4．2 體重丟失的評分:體重丟失百分率(ΔW)=納絡酮注射前與注射后1 h的體重差/納絡酮注射前體重×100%。ΔW的評分標準為:1=ΔW＜2%，5=ΔW＜4%，10=ΔW＜6%，15=ΔW＜8%，20=ΔW≥8%。

1．2．5 左側側腦室注射部位及其周圍腦組織損傷的鑒定:納絡酮注射后2 h，大鼠在0．4%戊巴比妥鈉(40mg/kg，側腦室內注射)麻醉下，將大鼠胸腹腔切開，暴露心臟。先剪開右心耳，見血液流出后，將左心室剪開，將已注入預冷0．9%氯化鈉溶液的灌注管從左心室插入升主動脈，快速灌注約150 ml預冷0．9%氯化鈉溶液，右心耳流出液變清亮后，灌注4%多甲醛。首先在20 min內灌注200 ml，隨后在40 min內灌注200 ml。取腦并將腦組織在4%多甲醛中固定2 h后，放入15%和30%梯度蔗糖溶液中直至沉底。肉眼觀察側腦室微量注射管定位。

1．3統計學分析應用SPSS 11．0統計軟件，計量資料以±s表示，進行單因素方差分析，兩兩比較用S-N-K法，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 側腦室微量注射管定位 觀察微量注射管定位準確，對周圍腦組織損傷較小。

2．2 側腦室注射CRE-decoy ODN對大鼠戒斷癥狀的影響 大鼠的戒斷癥狀由腹腔注射鹽酸納絡酮5 mg/kg催促。在腹腔注射納絡酮前，5組大鼠均未出現戒斷癥狀。在嗎啡戒斷大鼠側腦室注射CRE-decoy ODN 20 μg，可明顯抑制絕大部分戒斷癥狀。0～60 min內，CRE-decoy ODN治療組大鼠每15分鐘的行為學評分分別為(3．2 ±0．6)、(5．9 ±0．9)、(4．1 ±0．6)和(1．8±0．4)分，明顯低于戒斷組大鼠的(6．3 ±0．8)、(8．1 ±0．7)、(6．9 ±0．9)和(2．8 ±0．7)分，差異有統計學意義(P ＜0．01)。CRE-decoy ODN明顯抑制嗎啡戒斷大鼠0～60 min戒斷癥狀的總評分，使其從(24．0 ±0．7)分降至(15．0 ±0．9)分(P＜0．01)，并使反映戒斷癥狀綜合性指標的體重丟失百分率ΔW 從(7．2 ±1．2)%降至(4．1 ±0．8)%(P ＜0．01)。

3 討論

阿片藥物成癮的主要特征為耐受、戒斷綜合征及強迫用藥，目前對其形成的生物學基礎尚未闡明［1］。研究表明，反復應用阿片類藥物，機體啟動適應機制，導致對阿片敏感的神經元及神經網絡的功能發生短期及長期改變［9］。

尋找與成癮有關的極其穩定的分子適應機制所遇到的困難，與學習和記憶領域面對的挑戰相同［1，10］。可能的機制之一是通過CREB介導很短暫的基因表達改變，而介導神經元形態學和突觸結構的長期改變。例如，在海馬錐體神經元，增加樹突突起的密度及LTP時谷氨酸能突觸的效力。另一種可能是轉錄因子CREB的短暫激活通過修飾染色質，導致基因表達更持久的改變。CREB和許多其他的轉錄因子被認為通過促進靶基因周圍的組蛋白發生乙?；蛉ヒ阴；せ罨蛞种瓢谢蜣D錄。盡管組蛋白乙?；蛉ヒ阴；l生非?？?，但是CREB在控制組蛋白乙?；拿赶到y方面產生更持久的適應。CREB也可能通過調節DNA或組蛋白的甲基化使基因表達發生更持久的改變［10］。

CREB主要通過cAMP反應元件(cAMP response element，CRE)介導cAMP和Ca2+依賴的基因表達。CRE由TGACGTCA序列組成，主要位于許多基因啟動子內TATA盒上游100個核苷酸處［7，11］。酶復雜的級聯反應調控CREB的活性。細胞外刺激通過升高細胞內cAMP或游離Ca2+，在數分或數秒鐘后，CREB便被激活。隨著胞外刺激引起胞漿內cAMP水平升高，PKA的催化和調節亞單位迅速分離，催化亞單位被動移位至細胞核，并在細胞受到刺激后15～20 min達到高峰。PKA導致CREB內的PKA磷酸化位點(RRPSY)中Ser-133磷酸化。Ser-133磷酸化被認為是介導轉錄起始的關鍵事件，細胞內Ca2+水平升高通過Ca2+/鈣調蛋白依賴蛋白激酶Ⅳ(calmodulin-dependent kinaseⅣ，CaMKⅣ)使 Ser-133磷酸化。Ca2+激活CREB可通過鈣調蛋白從胞漿移位到胞核。當CREB經磷酸化激活形成pCREB時，pCREB便于特定的DNA序列CRE結合，從而啟動基因轉錄［7］。CREB與CRE結合形成的復合物是多效性激活劑，參與多種細胞及病毒基因轉錄。目前已知引起神經元可塑性和適應性改變，參與藥物依賴和耐受的mPer1［11，12］、nNOS［13］、CCK［14］和 fosB［15］基因等也受 CREB 調控。有研究認識到晝夜節律基因mPer1表達上調與藥物依賴密切相關，應用核酶切割mPer1基因有效減輕嗎啡戒斷小鼠的戒斷癥狀［12］。在體內應用NOS拮抗劑或反義寡核苷酸，阻斷NO的產生，可有效減輕實驗動物的嗎啡依賴及耐受，故NO被認為參與了嗎啡依賴和耐受［13］。CCK具有拮抗內源性阿片肽的作用，CCK-8是抗內源性阿片肽作用最強的神經肽，應用CCK-BR拮抗劑緩解大鼠嗎啡戒斷癥狀［14］。△FosB被認為是一種持續表達的分子開關，使急性藥物反應逐步轉化成相對穩定的適應狀態，造成藥物成癮時長期的神經元和行為可塑性改變［10］。

本研究以CREB為靶點，體外合成CRE-decoy ODN，在證明了CRE-decoy ODN能選擇性抑制慢性嗎啡誘導的SK-N-SH細胞CREB的DNA結合活性升高、nNOS和fosB基因表達上調的基礎上，進一步證實側腦室單次注射20 μg CRE-decoy ODN可明顯抑制嗎啡戒斷大鼠的戒斷癥狀。由于已證明在培養的SKN-SH細胞內，CRE-decoy ODN與細胞作用48 h仍能以非整合形式在細胞內穩定存在，故我們選擇在納絡酮注射前30 h行側腦室注射CRE-decoy ODN，基于兩方面的考慮:(1)使側腦室注射損傷有一定的愈合時間，盡可能減低對行為學觀察結果造成的影響;(2)保證有足夠的CRE-decoy ODN能發揮作用。

在實驗分組時中，設立側腦室注射對照組，通過比較側腦室注射對照組與0．9%氯化鈉溶液對照組的實驗結果，發現兩者無差異。另外，通過腦組織灌注固定，肉眼觀察，發現側腦室注射未對周圍腦組織造成明顯破壞。故可基本排除側腦室注射造成的損傷對實驗結果可能產生的影響。

本研究證實，CRE-decoy ODN可降低嗎啡戒斷大鼠每15分鐘內戒斷癥狀的評分(1 h內)、1 h內戒斷癥狀的總評分及體重丟失的戒斷評分，為探尋阿片類物質依賴的干預措施提供了可靠的實驗依據。

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