P53和Ki-67蛋白在宮腔脫落細胞中的表達及意義

牛鳳霞 賈利剛 張俊琴 張為霞 黃黛

子宮內(nèi)膜癌是女性常見的惡性腫瘤之一，高發(fā)年齡為58～61歲，發(fā)生率占女性癌癥總數(shù)的7%，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，近年來隨著我國人均壽命的延長，飲食結構的改變，外源性激素治療，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈上升趨勢，但有關子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的機制尚不明確，一旦發(fā)生轉移及復發(fā)，愈后較差［1］。本文利用宮腔脫落細胞中細胞塊，用免疫組化法檢測正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生、子宮內(nèi)膜癌的P53蛋白表達，同時檢測Ki-67在子宮內(nèi)膜發(fā)生發(fā)展中的作用，提高子宮內(nèi)膜癌的檢出率。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2006年6月至2009年5月，我院婦科門診患者108例，年齡35～78歲，平均年齡54.3歲;病例選擇陰道不規(guī)則出血、絕經(jīng)后出血、查體發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜增厚等。其中子宮內(nèi)膜癌32例，子宮內(nèi)膜不典型增生36例，正常子宮內(nèi)膜40例。

1.2 方法

1.2.1 取材方法:受檢者取膀胱截石位，碘伏消毒宮頸，將子宮內(nèi)膜細胞采集器在外套管的保護下，通過宮頸緩慢插入宮腔底部，讀出宮腔深度，回縮外套管推出采集器，順時針方向轉動3～5圈，將外套管向前推將采集器收入外套管中，連同一起退出宮腔，將采集環(huán)上的附著物立即投入液基小瓶中，做成液基薄層細胞涂片進行觀察，剩余液體制成蠟塊。

1.2.2 標本處理:將液基保存液瓶中的剩余液體(最好有肉眼可見的漂浮物)，以1500 r/min離心10 min，棄上清。0.9%氯化鈉溶液漂洗沉渣，以1000 r/min離心5 min，棄上清。加入4%甲醛，固定60 min，再以2000 r/min離心10 min，棄上清。加入60℃ 3%瓊脂攪勻，2000 r/min離心10 min。取出瓊脂塊，常規(guī)脫水、石蠟包埋。

1.2.3 HE染色及免疫組化染色法:細胞塊切成4 μm厚切片，常規(guī)HE染色，Ki-67、P53免疫組化染色，采用SP法，DAB顯色，即用型鼠抗人Ki-67、P53單克隆抗體，即用型SP試劑盒。

1.2.4 結果判定:P53、Ki-67蛋白表達為光學顯微鏡下見細胞核內(nèi)出現(xiàn)明確的棕黃色顆粒細胞為陽性細胞。結合半定量積分法［1］判斷蛋白表達結果，按染色強度打分，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，鏡下選擇10個高倍視野，計數(shù)100個細胞，計算其平均陽性百分率，根據(jù)平均陽性細胞的百分率分為4個等級，無陽性細胞為0分，陽性細胞≤10%為1分，≤50%為2分，≤75%為3分，＞75%為4分，染色強度與平均陽性細胞百分比的乘積＞3定為免疫反應陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

不同子宮內(nèi)膜組織中P53的表達分別為正常子宮內(nèi)膜7.5%(3/40)，子宮內(nèi)膜不典型增生 52.78%(19/36)，子宮內(nèi)膜癌87.5%(28/32)，3 組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=46.67，P＜0.01)，Ki-67在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜癌中的陽性表達分別為5.00%(2/40)、55.56%(20/36)、90.6%(29/32)，3 組間比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=53.8，P＜0.01)。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤。而對宮頸癌的早期篩查、早期診斷、早期治療已越來越受人們的重視，而且篩查方法也日趨完善，但對子宮內(nèi)膜癌的篩查及早診早治還沒有引起人們的足夠重視。往往臨床上一經(jīng)確診絕大部分已是Ⅰ期、Ⅱ期，甚至Ⅲ期，愈后較差，本研究旨在尋求一種篩查子宮內(nèi)膜癌，并利用免疫組化手段幫助診斷子宮內(nèi)膜病變。

以往診斷子宮內(nèi)膜癌最常用的方法是B型超聲檢查，對一些較典型的內(nèi)膜癌聲像圖診斷較明確，表現(xiàn)為子宮增大或絕經(jīng)后子宮相對增大，宮腔內(nèi)見實質不均回聲區(qū)，形態(tài)不規(guī)則，宮腔線消失，宮腔鏡檢查，可直視宮腔，若有癌灶生長能直接觀察癌灶大小、生長部位、形態(tài)，并直視下取活檢送病理檢查。但最終靠診刮術是最常用最可靠的方法，刮出組織送病理檢查。但由于診刮術的局限性，不是每個患者都能刮出組織，而且是有創(chuàng)的，操作較繁瑣，痛苦大、出血多，患者不易接受，本研究使用的是子宮內(nèi)膜采集器，具有價廉、簡單易行、無痛、出血少、器具一次性使用無交叉感染，準確性高的特點，門診大夫即可操作完成，特別是對一些有出血癥狀但內(nèi)膜又較薄，做診刮不易刮出組織的患者采取本方法彌補了這一不足。

P53基因蛋白是一種最常見的腫瘤抑制基因之一，野生型P53基因是通過停止細胞生長和誘導細胞凋亡而發(fā)揮其腫瘤抑制的功能，而突變型P53基因表達的蛋白可干擾野生型P53蛋白功能，因此突變型P53基因不僅喪失抑制活性反而具有促進惡性轉化的活性細胞傾向與增殖、轉化和癌變。P53基因蛋白已被廣泛用于各種腫瘤的標記，但用來標記宮腔脫落細胞評價子宮內(nèi)膜病變研究者甚少［2］。

TCT與細胞塊技術已成為宮頸癌篩查的主要手段，但用于篩查子宮內(nèi)膜癌研究者甚少，TCT標本制成細胞塊后，能將刷取的細胞盡可能地收集在一起，納入觀察范圍，細胞和細胞碎片經(jīng)離心制成石蠟切片后有相當一部分可以形成組織學模式，在一定程度上可觀察到組織的結構，經(jīng)HE染色后，鏡下接近組織學，背景清晰，細胞核漿更易觀察，同時再加免疫組化技術又彌補了細胞學診斷的局限性，本研究顯示，子宮內(nèi)膜癌中P53蛋白的表達明顯高于正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜不典型增生，且3組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，P53基因被認為是惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的主要原因，有研究表明突變型P53蛋白半衰期較野生型P53蛋白長，能沉積在細胞核中，故突變的P53蛋白用免疫組化法可以檢測出來，因此可以將檢測率看做突變率，在一定程度上能預測內(nèi)膜癌的惡性程度，及早發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌或癌前病變。同時我們又檢測了Ki-67蛋白的表達，Ki-67蛋白是反應細胞中增殖狀態(tài)的指標，經(jīng)研究已證實，在惡性腫瘤細胞中常呈高表達狀態(tài)，其表達程度的高低反映了細胞增殖狀態(tài)，廣泛應用于評價腫瘤細胞的增殖活性，本文研究發(fā)現(xiàn)Ki-67在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生、正常子宮內(nèi)膜中的表達分別為90.6%、55.6%、5.00%，3 組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。在某種程度上反映了Ki-67的陽性表達強度與子宮內(nèi)膜病變的嚴重程度呈正相關。

應用P53和Ki-67免疫組化染色有助于子宮內(nèi)膜病變的準確診斷，可作為診斷子宮內(nèi)膜病變的重要輔助指標。同時又彌補了脫落細胞學診斷的局限性，盡管本研究數(shù)據(jù)有限，尚需大樣本研究證實，但畢竟為臨床大夫提供了有效信息，指導患者隨訪和治療，有望成為篩查子宮內(nèi)膜癌的輔助手段。

1 邢小芬，李曉，喬書花，等.子宮內(nèi)膜的內(nèi)分泌細胞及其內(nèi)分泌分化機制的探討.河北醫(yī)藥，2010，32:3542-3544.

2 Caye-Thomasen P，Larsen K，T ingsgaard P，et al.Immunoh is tochem ical demons-tration and sem i-quantitation of vascular endothelial growth factor in recurrent versus non-recurrent nasal polyps.Acta Otolaryngol，2004，124:706.