一種精子無冷凍保護劑玻璃化冷凍新載體制備

羅樹偉 林戈 盧光琇

精子庫現已經成為輔助生殖技術重要組成部分，精子冷凍技術成熟是建立精子庫的基礎。精子的傳統冷凍方法40年代以甘油為冷凍保護劑慢速冷凍法[1]，經過50年代的完善和改良，一直沿用到現在。由于冷凍保護劑的毒性作用以及在冷凍過程中冰晶形成，慢速冷凍操作不適合少量精子樣本（嚴重少精癥精子樣本、睪丸穿刺和附睪穿刺精子樣本）的冷凍。為了有效保存這些少量精子，國內外學者采用各種不同的載體來冷凍少量精子，這些載體就包括了透明帶、cryloop環、銅環和ICSI注射針等。玻璃化冷凍最早是有Luyet在1937年提出，玻璃化冷凍可以完全避免冰晶行成對細胞的損傷，同時可以保持細胞內分子相對空間位置，自從1998年應用到人類胚胎冷凍上以來[2]，人類胚胎玻璃化冷凍越來越成為保存人類胚胎的主要的方式。精子與卵裂期胚胎不同，精子不能耐受滲透損傷，并且對冷凍保護劑毒性敏感，常規玻璃化冷凍方法不能保存少量精子，為此國內外學者采用無冷凍保護劑的方式玻璃化冷凍保存人類精子，并獲得初步成功[3-5]。為了減少精子質量對結果的影響，本研究采用正常精液來研究分析一種新型精子冷凍載體冷凍效果。

1 材料與方法

1.1 精液樣本的收集和處理 收集非男方因素IVF夫婦中男方精液，其中精液精子密度＞50×106/ml，a級+b級精子＞50％的精液標本列入研究對象，收集精液樣本10份，精子質量評估的標準參考世界衛生組織《人類精液及精子宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊標準》第四版[6]。將收集的精液37℃液化30～40分鐘，完全液化后，采用Isolate試劑行密度梯度離心分離活動精子，300g離心20分鐘，去上清，加入1ml精子洗滌液（GMOPS+5％HSA）混勻，200g離心5分鐘，去上清，在精子沉淀上加入1ml洗滌液，使沉淀和上層洗滌液形成清晰的分界線，45°傾斜離心管，37℃孵育20分鐘，然后取上清液體備用，并采用Makler板計數精子數目和活動精子數目。

1.2 精子伊紅染色 按照世界衛生組織《人類精液及精子宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊標準》第四版[6]配制精子伊紅染色試劑，用生理鹽水配制5g/L的伊紅Y染液，充分溶解，然后過濾備用。將一滴洗滌后或解凍后洗滌后精子懸液與一滴伊紅溶液在顯微鏡載玻片上充分混勻，并覆蓋玻片，30秒后在400倍光學顯微鏡下觀察，活精子不著色，死精子被染成紅色。

1.3 新型冷凍載體和開放式冷凍載體的制備 新型冷凍載體的制備：將普通胚胎冷凍麥管下端3cm區域采用細砂紙將外側面打磨粗糙。將麥管打磨區域沿麥管軸線剪一1/8圓周的細縫，選擇大小合適的輸液針套將麥管打磨區域套住。開放式冷凍載體的制備：按照Isachenko報道的方法制備[7]，取普通胚胎冷凍麥管，將其下端1cm區域沿軸線剪掉一半，使麥管下端1cm形成半圓形槽狀。分別在載體麥管上標記好標本號和管號。

1.4 新型冷凍載體精子懸液量承載量確定 將輸液針套套在打磨好的麥管下端，采用加樣槍分別加入10ul、9ul、8ul、7ul、6ul、5ul、4ul、3ul、2ul、1ul精子懸液，倒置麥管及輸液針套管，緩慢拉動輸液針套管，最終使輸液針套管脫離麥管，然后采用1ul加樣槍測量輸液針套管上存留的液體量，根據麥管打磨段液體存留情況和套管上存留液體量來判定新型載體液體承載量。

1.5 精子無冷凍保護劑玻璃化冷凍和解凍 新型載體精子冷凍，首先將輸液針套套緊在麥管打磨區域，采用加樣槍吸取5ul處理后的精子懸液加在輸液針套頭端，倒轉麥管，使套管位于上方，緩慢上體套管，使精子懸液均勻涂布在打磨好的麥管上，然后倒轉麥管，使麥管表面液體形成較均勻的液體薄層，迅速將麥管浸入液氮中，將麥管置外套管內。新型載體精子解凍，將精子洗滌液10ml加入到15ml錐形離心管中，37℃預熱30分鐘，從液氮中迅速取出冷凍麥管并置預熱好10ml洗滌液中，同時不停攪動，使迅速解凍，連續解凍5管，300g離心5分鐘，去上清，加洗滌液0.1ml，37℃孵育20分鐘，鏡下計數活動精子的數目，同時行精子伊紅染色，計數活精子和死精子數目。開放式載體精子冷凍，將洗滌好的精子懸液1ul，加入開放式載體下端的凹槽中，距離下端約0.5cm。迅速精開放式麥管侵入液氮中，將麥管置外套管內。開放式麥管載體精子解凍方法同新型載體精子解凍方法。

2 結果

2.1 新型精子冷凍載體可有效承載5ul精子懸液形成液體薄膜通過在輸液針套上加入不同量的精子懸液、麥管打磨段液體存留情況及套管上存留液體量，當加入精子懸液量≥7ul時，液體量存留量＞1ul，顛倒麥管可以看到明顯液體流動，加入6ul精子懸液時，存留液體量約1ul，當加入5ul精子懸液時，存留液體量＜1ul，加入液體量＜4ul時，套管上未有液體，麥管下端存在部分區域未涂抹液體。在顯微鏡下觀察2種載體上的精子，在新型載體上形成一薄層液體，液體中可見精子的存在，同時我們也發現新型載體也存在部分區域無薄層液體覆蓋。

2.2 新型精子冷凍載體具有良好的玻璃化冷凍效果 新型精子冷凍載體和開放式精子冷凍載體上精子冷凍后，以處理后未冷凍前精子懸液為對照[活動率（93±4）％，存活率（96±3）％]，新型載體和開放式載體解凍后精子活動率和存活率均下降，活動率分別為（70±2）％和（65±3）％，存活率分別為（74±4）％和（66±3）％（P＜0.05），新型載體明顯優于開放式載體。

3 討論

目前胚胎玻璃化冷凍技術已經廣泛應用到人類輔助生殖技術，玻璃化冷凍也慢慢應用到人類胚子中，如人類卵母細胞的冷凍，玻璃化冷凍技術是在人類輔助生殖技術中起著重要的作用，具有逐漸取代人類胚胎慢速程序冷凍的趨勢。玻璃化冷凍過程中需要加入高濃度的冷凍保護劑（30％～50％），慢速冷凍則需要5％～7％冷凍保護劑的濃度，高滲透壓不利于精子冷凍，然而，精子具有實現無冷凍保護劑玻璃化冷凍的條件，精子含有大量的蛋白質、糖和其他成分，在精子內估計可達45％～77％，而在卵裂球和卵母細胞中只占有20％～25％[4]。玻璃化冷凍和解凍的速度與冷凍保護劑的濃度呈現負相關，也就是說，高濃度的冷凍保護劑，需要相對較低的冷凍速度就可以實現玻璃化冷凍，冷凍的速度越快，實現玻璃化冷凍所需要冷凍保護劑的濃度越低[8]，當精子冷凍速度達到一定限度時，在精子內部并沒有見到冰晶的形成[9]。影響玻璃化冷凍的因素：液體的體積、溶質濃度、液體導熱性能、液體玻璃化溫度[10]，容易調整的因素為液體的體積，提高冷凍和解凍速度的方法降低液體體積和增大表面積/體積比，采用不同的載體來實現，冷凍載體選擇很重要，所以提高精子無冷凍保護劑玻璃化冷凍的重點就放在載體的設計上，目前比較常用的冷凍載體為loop環，loop環的液體承載量約20ul，所形成的液體薄層平均厚度為0.07cm，由于雙面接觸液氮，實際有效厚度為0.035cm，開放式載體精子懸液的液體承載量為1ul，假設其形成半球形，液體的厚度為球體半徑，為0.08cm，而本實驗所采用的新型冷凍載體的液體存在量約為5ul，麥管的直徑為1mm，如果液體精子懸液均勻涂布在麥管外表面，精子懸液可形成0.008cm，所形成液體厚度遠薄于開放式載體。新型載體與開放式載體相比較，所承載的精子液體量較多，但相對loop環載體承載量要小，新型載體存在的不足有：1）精子懸液不能均勻涂布在麥管外表面，可以考慮對麥管的內表面進行打磨，打磨的凹槽為螺旋形，由于表面張力的作用，精子懸液應該可以均勻涂布在麥管內表面，同時對麥管材料進行改良，用親水性材料制作麥管，以改善精子懸液的涂布，形成均一液體薄層；2）液體承載量相對較小，可以考慮適當加深凹槽的深度和凹槽長度，同時提高精子密度以減少精子懸液量。由于目前實驗條件所限制，不能在麥管內表面打磨細小凹槽，無法對新型載體進行進一步改良。總的來說，本實驗所采用的新型載體能有效承載精子進行精子無冷凍保護劑玻璃化冷凍，可作為精子無冷凍保護劑玻璃化冷凍的載體，并且具有改良優化的空間。

[1]Polge C,Smith,AU,et al.Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures[J].Nature,1949,164（4172）：666-676.

[2]Vajta G,Holm P.Open Pulled Straw（OPS）vitrification：a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos[J].Mol Reprod Dev,1998 51（1）：53-58.

[3]Nawroth F,Isachenko V.Vitrification of human spermatozoa without cryoprotectants[J].Cryo Letters,2002,23（2）：93-102.

[4]AbdelHafez F,Bedaiwy M.Techniques for cryopreservation of individual or small numbers of human spermatozoa：a systematic review[J].Hum Reprod Update,2009,15（2）：153-164.

[5]蔣凌英,靳雷,朱桂金,等.精子冷凍環無保護劑玻璃化冷凍方法的初步研究[J].生殖醫學雜志,2006,15（4）：234-236.

[6]世界衛生組織.WHO人類精液及精子-宮腔黏液相互作用實驗室檢驗手冊[M].4版.北京：人民衛生出版社,2001：51.

[7]Isachenko V,Isachenko E.Clean technique for cryoprotectant-free vitrification of human spermatozoa[J].Reprod Biomed Online,2005,10（3）：350-354.

[8]Fahy GM,MacFarlane DR.Vitrification as an approach to cryopreservation[J].Cryobiology 1984,21（4）：407-426.

[9]Morris GJ.Rapidly cooled human sperm：no evidence of intracellular ice formation[J].Hum Reprod.2006,21（8）：2075-2083.

[10]sachenko E,Isachenko V.Vitrification of mammalian spermatozoa in the absence of cryoprotectants：from past practical difficulties to present success[J].Reprod Biomed Online,2003,6（2）：191-200.