低能離子注入法選育透明質酸高產菌株

張 偉，姚 俊*，陳寬婷，孫榮斌，魏欽俊，曹 新

(1.南京醫科大學基礎醫學院生物技術系，江蘇 南京 210029；2.江蘇省常熟職業教育中心校旅游管理系，江蘇 常熟215500；3.南京醫科大學藥學院，江蘇 南京 210029)

低能離子注入法選育透明質酸高產菌株

張 偉1,2，姚 俊1,*，陳寬婷1，孫榮斌3，魏欽俊1，曹 新1

(1.南京醫科大學基礎醫學院生物技術系，江蘇 南京 210029；2.江蘇省常熟職業教育中心校旅游管理系，江蘇 常熟215500；3.南京醫科大學藥學院，江蘇 南京 210029)

以一株獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus) NN-7為出發菌株，利用30keV，劑量為8×1014N+/cm2氮離子進行誘變，篩選獲得溶血素和透明質酸酶雙缺陷型突變菌株，經搖瓶發酵培養篩選獲得一株透明質酸高產菌株SH-9，透明質酸產量達3.23g/L，相對分子質量達2.12×106，相對于原始菌株，透明質酸產量及相對分子質量分別提高了104.4%及35.9%。6代傳代實驗表明誘變后得到的高產透明質酸菌株具有較好的傳代穩定性。低能離子注入法可作為有效的誘變手段用于透明質酸高產菌株的選育。

透明質酸；獸疫鏈球菌；離子注入；誘變選育

透明質酸(hyaluronic acid，HA)是由β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖交替聚合而成的酸性黏多糖，相對分子質量在2×105～7×106之間[1]。HA獨特的線性分子結構和理化性質，使其具有良好的水溶性、吸水性、生物黏附性、生物相溶性、生物降解性，在工農業、食品與醫藥等領域極具應用潛力[2-5]。HA廣泛存在于脊椎動物的結締組織如公雞雞冠、臍帶、眼睛的玻璃體液和皮膚中，同時也存在于鏈球菌的莢膜中[2]。微生物發酵法是大量獲得HA的主要途徑，目前篩選的HA合成菌大多是鏈球菌屬的A群和C群，均為β溶血型，產HA也產透明質酸酶，為克服原菌株的不利因素，一般需進行育種處理才能獲得溶血素和透明質酸酶雙缺陷的HA高產菌株[6]。誘變劑育種由于方法簡便、突變率高、成本低廉，而廣泛用于HA合成菌的育種中，采用的誘變劑主要有紫外線、60Co、LiCl、硫酸二乙酯(DES)和亞硝基胍(NTG)等物理或化學誘變劑[7-9]。

近年來，離子注入技術逐漸從物質的表面修飾發展成為一種新型的生物物理誘變手段，具有以較小的生理損傷而得到較高的突變率、較廣的突變譜的優點，在優良菌株的篩選、誘變效率的提高以及離子束介導外源基因的轉入等方面發揮了重要的作用[10-12]。目前在HA產生菌株的誘變育種中應用低能離子注入的方式還未見報道。本實驗以獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus NN-7)為出發菌株，采用30keV氮離子注入法進行誘變，篩選HA高產菌株。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基與儀器

獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus NN-7)由南京醫科大學生物技術實驗室保藏。

馬丁肉湯培養基(g/L)：馬丁肉湯 20、蛋白胨 5、NaCl 3、NaHCO32、Na2HPO41、葡萄糖 10、瓊脂20， pH7.6；發酵培養基(g/L)：葡萄糖 30、胰蛋白胨25、MgSO4·7H2O 10、MnSO40.6、K2HPO410、KH2PO410、(NH4)2SO40.6，pH7.6；篩選培養基：血瓊脂平板用于非溶血性菌株篩選，在馬丁肉湯培養基中加入10%脫纖維羊血；透明質酸平板用于透明質酸酶缺陷型菌株篩選，在馬丁肉湯培養基中加入0.1%的透明質酸鈉。

LZD900多功能離子注入機 核工業部西南物理研究院。

1.2 方法

1.2.1 誘變方法

無菌條件下挑取獸疫鏈球菌NN-7在生理鹽水中懸浮，制成菌懸液，稀釋涂布于直徑為9cm的空平皿中心，使菌液形成一薄層；無菌風干后采用不同劑量的氮離子注入(能量30keV)進行輻照；輻照后用無菌棉球洗擦平皿菌層，將帶菌棉球放入裝有玻璃珠的無菌水試管中振蕩，逐級10倍稀釋后涂布于血瓊脂平板培養基培養。

1.2.2 初篩方法

血溶素缺陷型：原始菌株NN-7經低能離子誘變后，在血瓊脂平板培養基上培養48h，用無菌牙簽挑取無溶血性的菌落接種于馬丁肉湯斜面培養基保存。

透明質酸酶缺陷型：血溶性缺陷型菌株經低能離子誘變后(操作同1.2.1節)，將存活菌株接種到含透明質酸鈉的篩選培養基平板上，培養16h后噴灑1%十六烷基吡啶溶液，用無菌牙簽挑取長勢好且無混濁圈的菌落接種于馬丁肉湯斜面培養基保存。

1.2.3 復篩方法

取初篩保藏的斜面，用接種環接一環菌于裝有50mL液體發酵培養基的250mL三角瓶中，于37℃、250r/min發酵培養44h后測定HA產量及相對分子質量。

1.3 指標測定方法

1.3.1 HA含量的測定

將發酵液以4000r/min離心20min，取上清液1mL，加入2.5倍體積無水乙醇，混勻后置4℃冰箱中保存1h，離心收集沉淀，加入5mL蒸餾水稀釋沉淀，采用Bitter-Muir咔唑法測定HA的含量[13]。

1.3.2 HA相對分子質量的測定

以0.2mol/L NaCl溶液為參比液，采用毛細管內徑0.6mm的烏氏黏度計于25℃測定HA溶液的黏度，并計算其特性黏度值，再根據公式[η]=3.6×10-4Mr0.78(式中：[η]為特性黏度；Mr為相對分子質量)計算出HA的相對分子質量[14]。

2 結果與分析

2.1 離子注入劑量的選擇

采用不同氮離子劑量誘變處理獸疫鏈球菌NN-7，方法如1.2.1節所述，考察氮離子注入劑量與供試菌株致死率的關系，結果如圖1所示。

圖1 N+注入輻照獸疫鏈球菌NN-7的存活率曲線Fig.1 Relationship between survival rate and N+implantation dose

從圖1可以看出，隨著N+注入劑量的增加，獸疫鏈球菌NN-7的存活率曲線呈先減小后增大再減小的“馬鞍型”劑量-效應曲線，這是離子注入誘變所特有的誘變效應的重要表現，與一般電離輻射造成的“指數型”劑量-效應曲線不同。這是因為低劑量離子只對細胞表面進行損傷和刻蝕，隨著注入劑量的增加，能量沉積所產生的大量自由基致使DNA和生物膜等其他大分子損傷，從而造成存活率急劇下降，但當劑量增加至一定閾值時，注入細胞的庫侖力形成一個“保護屏障”并由此激活細胞內的修復機制和修復酶，使得存活率回升，但隨著劑量繼續增加，細胞損傷加劇，從而使得存活率再次下降[10-12]。

不同劑量N+注入輻照對菌株突變率和正突變率的影響如表1所示。隨著劑量的增加，菌株的突變率和正突變率也隨之增加，當注入劑量為8×1014N+/cm2時，菌株的正突變率最高，超過此劑量后，菌株突變率繼續增加，但正突變率呈下降趨勢。現代育種理論認為：被誘變的微生物致死率在75%左右時產量性狀的正突變率較高，在更高的致死率條件下，突變率雖可能較高，但負突變率較之正突變率高很多，不利于正突變菌株的篩選[15]。因此根據圖1和表1結果，選擇劑量為8×1014N+/cm2作為HA產生菌的離子注入劑量，實驗證明該注入劑量在誘變過程中較為有效。

2.2 離子注入后HA產生菌突變株的篩選

圖2 突變株S-7與原始菌株的菌落形態對比Fig.2 Colony morphology of mutant strain (S-7) and original strain (blank)

菌株經離子注入后，涂布于血瓊脂平板培養基上，從中篩選出溶血素缺陷型突變菌株25株，并對其進行搖瓶發酵實驗進行復篩，發酵后測定HA產量及相對分子質量，11株HA產量及相對分子質量較高的菌株的實驗結果見表2。經離子注入誘變后比較原始菌株和誘變菌株的菌落形態，突變株S-7于血瓊脂平板培養基培養無明顯的溶血圈出現(圖2)，且發酵合成的HA產量和相對分子質量均有較大提高，故確定S-7菌株作為下一輪注入誘變的出發菌株。

以S-7菌株為出發菌株再次進行注入誘變，系列稀釋后涂布于透明質酸平板培養基上，從中篩選出透明質酸酶缺陷型突變菌株17株，并對其進行搖瓶發酵實驗進行復篩，發酵后測定HA產量及相對分子質量，部分結果見表3。

對照出發菌株S-7，由表3可知，經氮離子注入誘變、透明質酸平板培養基篩選及搖瓶發酵后，有少數菌發生了負突變，不過正突變的菌株占絕大多數，其中SH-9菌株HA產量最高為3.23g/L，比原始菌株NN-7提高了104.4%，相對分子質量為2.12×106，比原始菌株NN-7提高了35.9%。

2.3 高產菌株SH-9的遺傳穩定性

對SH-9菌株連續傳代6次，每次均涂布于血瓊脂平板培養基上培養，并分別進行搖瓶發酵后檢測HA產量及相對分子質量，結果如表4所示。實驗證明6次傳代后突變株都無溶血圈。從傳代結果可以看出，該高產HA菌株的遺傳性能穩定，是一株適合HA生產要求的菌株。

表1 N+注入輻照對菌株突變率及正突變率的影響Table 1 Effect of N+implantation on mutation rate and positive mutation rate

表2 經N+誘變后溶血素酶缺陷型突變株的篩選結果Table 2 Screening results of hemolysin-degrading enzyme deficient mutant strains induced by N+implantation

表3 經N+誘變后透明質酸酶缺陷型突變株的篩選結果Table 3 Screening results of hyaluronic acid-degrading enzyme deficient mutant strains induced by N+implantation

表4 SH-9菌株傳代后HA產量及相對分子質量的變化Table 4 The yield and relative molecular weight of hyaluronic acid produced by cultured SH-9 strain

3 結 論

本實驗采用低能氮離子注入的方法用于HA合成菌株的誘變選育，結果表明，不同注入劑量與菌株的死亡率存在一定的關系，隨著注入劑量的增加，菌株致死率也隨之增大，在劑量為8×1014N+/cm2時菌株致死率達到76%，且在血瓊脂平板培養基和透明質酸平板培養基上的正突變率也較高；在經N+離子注入誘變后，篩選獲得一株溶血素和透明質酸酶雙缺陷型突變株SH-9；經搖瓶發酵，突變株SH-9合成的HA產量達3.23g/L，比原始菌株的合成水平提高了104.4%，HA相對分子質量為2.12×106，比原始菌株提高了35.9%，因而低能氮離子注入的方法可作為有效手段用于HA高產菌株的誘變選育。

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Screening of High-yield Hyaluronic Acid-producing Strain by Low Energy Ion Implantation

ZHANG Wei1,2，YAO Jun1,*，CHEN Kuan-ting1，SUN Rong-bin3，WEI Qin-jun1，CAO Xin1
(1. Department of Biotechnology, School of Basic Medical Science, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China；2. Department of Tourism Management, Changshu Central School of Vocational Education, Changshu 215500, China；3. School of Pharmacy, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

Streptococcus zooepidemicus NN-7 was subjected to mutagenesis by means of low energy ion implantation of 8× 1014N+/cm2dose at 30 keV. After culture in selective medium, the mutant strains with double deficiency of hemolysin and hyaluronic acid-degrading enzyme were screened. Among these strains, a mutant strain capable of producing a high yield of hyaluronic acid was selected and designated as SH-9. The strain still revealed excellent passage stability after six generations. The yield of hyaluronic acid reached up to 3.23 g/L with determined relative molecular weight (Mr) of 2.12×106. Compared with the original parent strain, the yield and molecular weight of hyaluronic acid derived from SH-9 were increased by 104.4%and 35.9%, respectively.

hyaluronic acid；Streptococcus zooepidemicus；ion implantation；mutation screening

Q933

A

1002-6630(2011)07-0269-04

2010-08-24

江蘇省高校自然科學研究計劃項目(09KJB530007)

張偉(1975—)，男，助教，學士，研究方向為生物高分子。E-mail：jscswx2000@yahoo.com.cn

*通信作者：姚俊(1979—)，男，講師，博士，研究方向為生物醫用材料。E-mail：joelyao@163.com