地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶純化和性質研究

傅明亮，劉曉杰，劉 婧，何國慶，陳啟和*

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310029)

地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶純化和性質研究

傅明亮，劉曉杰，劉 婧，何國慶，陳啟和*

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310029)

用地衣芽孢桿菌發酵液制備彈性蛋白酶粗酶液，采用硫酸銨分級沉淀和Sephadex凝膠柱層析的方法分離純化彈性蛋白酶，并對彈性蛋白酶的酶學性質進行研究。結果表明：彈性蛋白酶粗酶液經40%～70%飽和度的硫酸銨純化后比活力提高到120U/mg，經凝膠柱層析純化后比活力可達到292U/mg，純化倍數為12.6，SDS-PAGE法證實彈性蛋白酶分子質量為29.5kD。對酶學性質的研究結果表明：彈性蛋白酶最適反應溫度為55℃，最適反應pH值為7.4，以剛果紅-彈性蛋白為底物，米氏常數Km為9.67mg/mL。低濃度金屬離子Ca2+和K+對酶活力有促進作用，而Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+對酶活力則有抑制作用。

地衣芽孢桿菌ZJUEL31410；彈性蛋白酶；純化；酶學性質

彈性蛋白酶(EC 3.4.4.7，elastase)，是一種以水解不溶性彈性蛋白為特征的蛋白水解酶，可作為治療高血脂癥、防止動脈粥樣硬化的生化藥物[1]。蘭辛[2]研究發現，彈性蛋白酶能有效抑制用高脂高營養飼料喂養小鼠的血清和膽固醇的升高，降低體內甘油三酯(TG)和丙二醛含量(MDA)。此外，由于彈性蛋白酶能夠專一降解結締組織中堅韌的彈性纖維組分，當其他蛋白與彈性蛋白共存時，此酶優先對彈性蛋白水解，因此彈性蛋白酶可以作為理想的肉類嫩化劑用于食品加工業[3]。

彈性蛋白酶可由動物胰臟提取或由微生物發酵制得，我國彈性蛋白酶的生產主要從豬胰臟提取，但由于臟器資源利用受限制，彈性蛋白酶向來供不應求，因此研究者都轉向微生物發酵法制備彈性蛋白酶[4]。微生物彈性蛋白酶與豬胰彈性蛋白酶一樣，具有廣泛的水解活性，不但能降解彈性硬蛋白，而且對酪蛋白、明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白、白蛋白等多種蛋白質都有分解作用，是一種廣譜的肽鏈內切酶。利用微生物大規模工業化發酵生產彈性蛋白酶在國外早已開始，并取得了巨大進展，已經出現了商品化的彈性蛋白酶[5]。國外學者已發現一系列具有產彈性蛋白酶能力的微生物，包括P.aeruginosa、F. immotum、B. subtilis等[6-8]。近年來，國內學者也從土壤中分離出大批菌株，經鑒定這些菌株大多屬于芽孢桿菌屬[9-11]。本課題組在前期研究中從肉聯廠和屠宰場附近的土壤中分離篩選獲得一株高產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌[12]，本實驗對該地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶進行分離純化并對其酶學性質進行研究，以期為地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的開發應用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis ZJUEL31410為本課題組從土壤中分離所得，現保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC 1397。

剛果紅-彈性蛋白、Marker蛋白 美國Sigma公司；酪蛋白 上海研生生化試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250 美國Fluka公司；Sephadex G-100 美國Phamacia公司。

發酵培養基(g/L)：酪蛋白11.30、葡萄糖74.0、玉米提取物6.16、K2HPO22.06、MgSO4·2H2O 0.34，pH7.5。

1.2 儀器與設備

HD-93-1型核酸蛋白檢測儀 上海金達生化儀器廠；恒流泵、分步收集器 上海精科實業有限公司；JS-380A自動凝膠成像系統 上海培清科技有限公司；DH-8D型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；Beckman冷凍高速離心機 美國Beckman公司； TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；Christ ALPHA 1-4 LD Plus針孔冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.3 培養方法

斜面種子活化完成后，轉接一環用于液體種子的培育，37℃培養18h后，按5%的接種量接種于發酵培養基，在旋轉式搖床上于37℃、轉速220r/min條件下發酵培養24h。250mL三角瓶中液體種子和發酵培養基裝液量為25mL。

1.4 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性測定

彈性蛋白酶活力測定采用分光光度法，見文獻[12]。稱取20mg剛果紅-彈性蛋白溶于1mL水中，加1mL pH7.4、0.2mol/L的硼酸緩沖液和1mL適當稀釋的酶液于37℃振蕩反應20min，加入pH6.0、0.7mol/L磷酸鈉緩沖液2mL終止反應，過濾后取上清液在波長495nm處測定光密度，采用蒸餾水替代酶液的反應體系為空白。在此反應條件下溶解1mg剛果紅-彈性蛋白底物所需的酶量定義為1個彈性蛋白酶活力單位(U)。

1.5 硫酸銨分級鹽析

硫酸銨分級鹽析方法參見文獻[13]。

1.6 SephadexG-100凝膠柱層析

鹽析獲得的沉淀物溶解于0.2mol/L pH7.4硼酸緩沖液中，活性炭脫色后，用0.2mol/L的硼酸緩沖液透析至透析液中檢測不到銨根離子，過Sephadex G-100柱(3cm× 100cm)，用相同的緩沖液進行洗脫，流速為15mL/h，用核酸/蛋白檢測儀檢測，分步收集有酶活性組分，每管2mL，用去離子水透析過夜，冷凍濃縮后于4℃保存，用于SDS-PAGE電泳和酶學性質研究。

1.7 SDS-PAGE電泳

采用垂直式SDS-PAGE凝膠電泳，12%的分離膠和5%的濃縮膠，其具體實驗操作方法和步驟見文獻[14]，用凝膠成像系統對電泳所得的條帶進行分析，以驗證各純化步驟的效果并確定彈性蛋白酶的分子質量。

1.8 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶酶學性質研究

1.8.1 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶分子質量測定

將樣品與已知分子質量的蛋白Marker進行SDSPAGE電泳，然后以相對遷移率計算出地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的分子質量。

1.8.2 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶最適反應pH值測定

將地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶分別加到pH值為6.0、6.5、7.0、7.4、8.0、8.5、9.0的緩沖液中，在37℃條件下測定酶活力，以最高酶活力為100%，其他與之相比計算相對酶活力，考察酶最適反應pH值。

1.8.3 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶最適反應溫度測定

地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶在最適反應pH值條件下，分別在不同溫度(30、37、45、50、55、60、70℃)條件下測定酶活力，以最高酶活力為100%，其他與之相比計算相對酶活力，考察酶最適反應溫度。

1.8.4 金屬離子對地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性的影響

將地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶分別加到含0.3、3mol/L的Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+的溶液中，37℃保溫4h后，在37℃、pH7.4條件下測定酶活力，以浸泡前的酶活力為對照，計算相對酶活力，考察酶的金屬離子穩定性。

1.8.5 彈性蛋白酶的反應動力學

在pH7.4條件下，配制不同濃度的剛果紅-彈性蛋白底物，37℃條件下反應，測定彈性蛋白酶的反應初始速率，以反應速率倒數1/v為縱坐標，底物濃度倒數1/[S]為橫坐標作圖，得到斜率為Km/vmax的直線，由此得到Km值。

2 結果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的純化

在最佳產酶條件下，發酵制備得到地衣芽孢桿菌的發酵液，經過離心，其上清液即為粗酶液。粗酶液經不同飽和度的硫酸銨沉淀后測定酶活力。結果表明地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶主要集中在40%～70%硫酸銨飽和度的沉淀中，因此硫酸銨分級沉淀范圍為40%～70%飽和度。將硫酸銨分級沉淀后得到的蛋白溶液透析濃縮，用Sephadex G-100凝膠層析柱層析純化，結果見表1，兩步純化后，地衣芽孢桿菌蛋白酶純化了近13倍。

表1 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶純化步驟及其結果Table 1 Separation and purification procedures for Bacillus sp. EL31410 elastase

2.2 SDS-PAGE檢測地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的純度

圖1 SDS-PAGE凝膠電泳結果Fig.1 SDS-PAGE of crudely separated elastase and purified elastase

從圖1可以看出，經各步純化后電泳圖譜中蛋白質條帶依次減少，Sephadex G-100柱層析后得到一條帶，即純化后的地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶條帶。將該條帶與Marker標準蛋白分子質量對比并根據相對遷移率可計算出地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶分子質量大約為29.5kD。

2.3 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶酶學性質分析

2.3.1 酶的最適作用pH值

圖2 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適作用pH值Fig.2 Optimal reaction pH of Bacillus sp.EL31410 elastase

如圖2所示，地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶與底物的最適反應pH值為7.4，且在pH7.4～8.0的堿性條件下酶活力較好。

2.3.2 酶的最適反應溫度

圖3 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適作用溫度Fig.3 Optimal reaction temperature of Bacillus sp.EL31410 elastase

如圖3所示，地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶在55℃時酶活力最高，故最適反應溫度為55℃，而且在60℃時相對酶活力與55℃非常接近，僅下降了8%，而60～70℃時相對酶活力下降很快，70℃時酶活力只剩最高時的55%。

2.3.3 金屬離子對地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性的影響

表2 不同金屬離子對地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性的影響Table 2 Effect of different metal ions on Bacillus sp.EL31410 elastase activity

從表2可知，高濃度的金屬離子對地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活力影響很大，尤其是高濃度的Zn2+和Al3+，在此條件下酶幾乎失活。在這6種金屬離子中，低濃度的Ca2+和K+能激活地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性，而Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+可不同程度地抑制地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性，與谷新晰等[15]在重組畢赤酵母中獲得的彈性蛋白酶性質相似。

2.3.4 彈性蛋白酶的酶解動力學

以剛果紅-彈性蛋白為底物測定了地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的酶解動力學常數，以1/v對1/[S]做圖得一直線，經計算得出線性方程為y=44.139x＋4.5637。如圖4所示，直線的斜率為Km/vmax，直線與縱軸交于1/vmax，與橫軸交于-1/Km。從方程可知，Km為9.67mg/mL。

圖4 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的酶解Lineweaver-Burk圖Fig.4 Lineweaver-Burk plot of elastase with elastin-Congo red as the substrate

3 結 論

3.1 本實驗采用兩步法純化地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶，同時用SDS-PAGE測定其分子質量。結果顯示，利用40%～70%的硫酸銨分級鹽析和Sephadex G-100凝膠層析后，地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶比活力較粗酶液提高了近13倍，在SDS-PAGE凝膠圖譜中得到比較明晰的條帶，計算出其分子質量約為29.5kD。

3.2 通過對層析純化后地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的酶學性質研究表明，其最適作用溫度為55℃，最適作用pH值為7.4。此外，考察了多種金屬離子對地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活力的影響，發現低濃度Ca2+和K+對其有激活作用，而其他離子可不同程度地抑制其活性。以剛果紅-彈性蛋白為底物，對地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的酶解動力學常數進行了研究，其酶解反應的米氏常數Km為9.67mg/mL。

[1] 陳啟和. 彈性蛋白酶發酵工藝及其發酵動力學研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2003.

[2] 蘭辛. 彈性蛋白酶在調節血脂及預防改善酒精肝方面的作用研究[J].現代食品科技, 2008, 24(11): 17-19.

[3] 劉小杰, 陳啟和, 孫橋. 彈性蛋白酶的研究進展[J]. 中國食品添加劑, 2004(4): 29-32.

[4] 章海鋒, 劉婧, 楊潞芳, 等. 微生物產彈性蛋白酶分子研究進展[J].糧油加工, 2008(8): 110-112.

[5] 顏子穎, 關國雄. 微生物彈性蛋白酶的研究進展[J]. 微生物學通報, 1991, 18(6): 356-359.

[6] MORIHARA K, TSUZUKI H, OKA T, et al. Pseudomonas aeruginosa elastase isolation, crystallization, and preliminary characterization[J]. J Biol Chem, 1965, 240(18): 3295-3303.

[7] SHIIO I, OZAKI H. Properties of elastolytic enzymes from Flavobacterium immotum[J]. J Biochem, 1975, 77: 171-180.

[8] KAUR M, TRIPATHI K K, GUPTA M, et al. Production and partial characterization of elastase of Bacillus subtilis isolated from the cervices of human females[J]. Canad J Microbiol, 1988, 34: 855-859.

[9] 劉雙發, 安德榮, 茍麗霞, 等. 新的產彈性蛋白酶菌株的篩選與鑒定[J]. 微生物學報, 2009, 36(9): 1345-1349.

[10] 張娟, 劉書亮, 吳琦, 等. 產彈性蛋白酶芽孢桿菌的篩選與鑒定[J].四川農業大學學報, 2007, 25(3): 253-256.

[11] 方尚玲, 吉園. 彈性蛋白酶產生菌的分離鑒定和發酵條件研究[J]. 食品科學, 2007, 28(11): 306-309.

[12] 陳啟和, 何國慶, 鄔應龍. 彈性蛋白酶產生菌的篩選及其發酵條件的初步研究[J]. 浙江大學學報: 農業與生命科學版, 2003(1): 59-64.

[13] 趙永芳. 生物化學技術原理及其應用[M]. 4版. 武漢: 武漢大學出版社, 2008.

[14] HAMES B D, RICKWOOD D. Gel electrophoresis of proteins: a practical approach[M]. 2nd ed. Oxford: Oxford University Press, 1990.

[15] 谷新晰, 許文濤, 黃昆侖, 等. 重組彈性蛋白酶誘導表達、純化及酶學特性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(19): 227-231.

Purification and Characteristics of Elastase Produced by Bacillus licheniformis

FU Ming-liang，LIU Xiao-jie，LIU Jing，HE Guo-qing，CHEN Qi-he*
(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

The fermentation supernatant (rich in elastase) of Bacillus licheniformis ZJUEL31410, a strain isolated from soil, was used as a crude enzyme solution, from which elastase was separated by (NH4)2SO4segmentation precipitation and purified by Sephadex gel column chromatography. The enzymatic characteristics of purified elastase were measured. The specific activity of elastase could be increased to 120 U/mg through (NH4)2SO4precipitation with 40%-70% saturation degree and continually increased to 292 U/mg after Sephadex gel column purification and the purification fold was 12.6. SDS-PAGE studies demonstrated that the enzyme had a molecular weight of 29.5 kD. The optimum reaction temperature and pH were 55 ℃ and 7.4, respectively, and the Michaelis constant Km was 9.67 mg/mL with elastin-Congo red as the substrate. Low concentrations of Ca2+and K+could enhance elastase activity, while Mg2+, Mn2+, Zn2+and Al3+revealed an inhibition effect.

Bacillus licheniformis ZJUEL31410；elastase；purification；enzymatic properties

TS201

A

1002-6630(2011)07-0216-04

2010-06-06

浙江省自然科學基金項目(Y307405)

傅明亮(1987—)，男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：fuml@zju.edu.cn

*通信作者：陳啟和(1975—)，男，副教授，博士，研究方向為生物技術與生物工程。E-mail：chenqh@zju.edu.cn