富硒螺旋藻多肽對血管緊張素轉化酶的抑制作用

高冬芳，張逸波，凌欽婕，鄒 穎，黃 峙*

(暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632)

富硒螺旋藻多肽對血管緊張素轉化酶的抑制作用

高冬芳，張逸波，凌欽婕，鄒 穎，黃 峙*

(暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632)

從富硒螺旋藻(SeSP)中提取總蛋白(SeSP-TP)，用不同蛋白酶水解SeSP-TP制備富硒螺旋藻多肽(SeSP-Ps)，體外測定SeSP-Ps對血管緊張素轉化酶(ACE)的抑制作用。結果表明：5種常見蛋白酶在最適條件下對SeSP-TP水解度明顯不同，其中胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯合使用時的酶水解度最高；雖然不同蛋白酶水解制備的SeSP-Ps均對ACE具有較強的抑制作用，但不同酶水解的SeSP-Ps對ACE的50%抑制濃度(IC50)存在明顯差異，其中胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯合酶解制備的SeSP-Ps對ACE的IC50值最低，為74.6μg/mL。結果提示：SeSP在體內經胃腸蛋白酶消化產生的多肽，對ACE具有較強的抑制活性，且SeSP-Ps對ACE的抑制作用呈現顯著的劑量-效應依賴性。

血管緊張素轉化酶(ACE)；螺旋藻；硒；多肽

螺旋藻(Spirulina platensis，SP)具有預防心腦血管疾病、抗腫瘤、抗病毒等輔助藥用價值[1]。硒(selenium，Se)是人體必需微量元素之一，缺硒與克山病、糖尿病、腫瘤等數10種疾病有關。SP是無機硒生物有機化的理想載體[2-4]，前期的研究證實了富硒螺旋藻(selenium enriched Spirulina platensis，SeSP)、SeSP總蛋白(SeSP-TP)和硒藻藍蛋白(Se phycocyanin，Se-PC)具有拮抗肝損傷和纖維化及誘導腫瘤細胞凋亡等方面的生物學活性，發現含硒蛋白質是SeSP中的主要活性組分[5-10]。

血管緊張素轉化酶(angiotensin convert enzyme，ACE)催化血管緊張素Ⅰ生成血管緊張素Ⅱ，使小動脈血管平滑肌收縮，引起血壓迅速上升[11]。抑制ACE的活性，可以有效阻止血管緊張素Ⅱ的生成，從而達到降壓作用。近年來，研究者已證實食品不同來源的ACE抑制多肽有250余種[12-14]。本研究從SeSP中提取SeSP-TP，用不同蛋白酶水解SeSP-TP制備富硒螺旋藻多肽(SeSP peptides，SeSP-Ps)，體外測定SeSP-Ps對血管緊張素轉化酶(ACE)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis Nordst. Geitler)藻種取自暨南大學水生生物研究所。

胃蛋白酶(pepsin，2500U/mg)、胰蛋白酶(trypsin，10000U/mg)、木瓜蛋白酶(papain，200U/mg)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin，1500U/mg)、堿性蛋白酶(alcalase，200U/mg)、馬尿酰-組胺酰-亮氨酸(Nhippuryl-His-Leu hydrate，HHL)、血管緊張素轉化酶(ACE，10U/mg) 美國Sigma公司；BCA法蛋白質定量試劑盒、HEPES和PBS緩沖液 鼎國生物技術公司；亞硒酸鈉、丙酮、乙酸乙酯等試劑均為分析純。實驗全部采用Milli Q水。

LRH-250-B型光照培養箱、TGL-16G型冷凍高速離心機 上海醫用分析儀器廠；JY92-IID型超聲細胞破碎儀 湖北泰維醫療科技公司；S54型紫外-可見分光光度計 廣州光學儀器廠。

1.2 富硒螺旋藻(SeSP)的培養

采用Zarrouk培養基培養保種[2]。取對數生長期的鈍頂螺旋藻藻種，接種于5L鼓泡培養瓶內，接種量為OD560nm值為0.10。培養條件：溫度33～35℃，pH8.8～9.5，光照強度4000lx，光照時間16h/d。在培養周期的第7、8、9天，分3次等量加入200μg/L亞硒酸鈉。第10天過濾收集藻細胞。

1.3 富硒螺旋藻水溶性總蛋白(SeSP-TP)的提取

取藻細胞25g，加入120mL PBS緩沖液(pH7.2)，反復凍融3次，冰浴超聲破碎30min(5s破碎，10s間隔；功率800W)，12000×g離心30min去掉細胞碎片，5倍體積-20℃預冷丙酮沉淀過夜，12000×g離心15min收集沉淀蛋白，冰浴待丙酮揮發干凈后，加入1mL PBS復溶。采用BCA法測定蛋白質濃度[9]。

1.4 富硒螺旋藻蛋白多肽(SeSP-Ps)的制備

取1mg SeSP-TP加入0.3U蛋白酶進行酶解，經大量預實驗，不同蛋白酶的最適酶解條件如表1所示。胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯合水解方案：先用胃蛋白酶在37℃、pH1.5條件下水解6h，再用胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶酶活力比為10:1的比例在37℃、pH7.5條件下水解6h[13]。水解過程中采用0.1mol/L的NaOH溶液調節反應體系的pH值。水解結束，沸水浴15min終止反應。用截留分子質量為10kD的超濾管超濾所有酶解樣品，冷凍干燥，得SeSP-Ps。

表1 不同蛋白酶水解SeSP-TP的最適條件Table 1 Optimal conditions for SeSP-TP hydrolysis by different proteases

1.5 蛋白酶水解度(hydrolysis degree，HD)的測定

采用水解后多肽的質量與水解前蛋白質的質量之間的比值作為蛋白酶水解度。多肽質量濃度測定方法如下，調整SeSP-Ps及對照組的稀釋倍數，分別測定215nm和225nm波長處的吸光度，根據文獻[13]計算多肽質量濃度。

1.6 ACE抑制率測定

ACE活性測定方法參見文獻[12]，將20μL SeSP-Ps、0.3mU ACE、20μL緩沖溶液(HEPE-NaCl緩沖液，50mmol/L，pH8.3，含300mmol/L NaCl)，37℃孵化15min。加入20μL 6.5mmol/L HHL，37℃孵化1h后用1mol/L的HCl終止反應。加入200μL乙酸乙酯萃取反應產物馬尿酸(Hip)，取上層150μL，減壓離心(40℃、真空度0.090MPa)去除乙酸乙酯，固體用500μL Milli Q水溶解，測228nm波長處的光吸收度(產物馬尿酸在228nm波長處有特征吸收峰)。SeSP-Ps對ACE的抑制率按式(2)計算。

1.7 硒含量檢測

參照文獻[15]的方法，將100mg的樣品混合5mL的消化液(濃硝酸:高氯酸體積比3:1)，200℃消化6h，待溶液完全澄清之后停止，12000×g離心去沉淀。用Milli Q水稀釋到5mL，用ICP-AES測定硒含量。

1.8 統計分析

所有實驗重復3次。結果以x±s表示，統計分析采用SPSS 13.0處理，進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 SeSP和SeSP-TP中Se含量

如圖1所示，SeSP和SeSP-TP中硒含量分別為402μg/g和314μg/g，說明SeSP代謝轉化的硒75%以上存在于藻體蛋白質中，也提示SeSP-TP經酶解后可獲得含硒的水解多肽。

圖1 SeSP和SeSP-TP中硒含量Fig.1 Se concentrations of SeSP and SeSP-TP

2.2 不同蛋白酶對SeSP-TP的水解度

圖2 不同蛋白酶對SeSP-TP的水解度Fig.2 Time courses of hydrolysis degree of SeSP-TP by different proteases

如圖2所示，5種蛋白酶對SeSP-TP的水解度依次為：堿性蛋白酶(alcalase)＞胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)＞木瓜蛋白酶(papain)＞胃蛋白酶(pepsin)＞胰蛋白酶(trypsin)。雖然胰蛋白酶和胃蛋白酶對SeSP-TP的水解度較低，分別為37.1%和36.4%，但是，當胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯合使用時對SeSP-TP的水解度最高，可以達到81.2%，且持續時間長。胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯合使用模擬了人體消化道酶系統，說明SeSP-TP可被人體消化利用的效率很高，明顯優于其他體外蛋白酶單獨作用，因此，SeSP產品無需體外酶解，是一種優質功能性食品，具有強大的應用潛力。在整個水解過程中，隨著水解度的升高，水解速率逐漸減低，符合蛋白酶水解過程中由于底物被分解而造成的反應平衡變化的規律。

2.3 SeSP-Ps對ACE的抑制率

圖3 螺旋藻蛋白水解多肽對ACE的抑制率Fig.3 ACE inhibition rates of SeSP-Ps hydrolysates obtained with different proteases

如圖3所示，5種蛋白酶水解多肽對ACE抑制率依次為：木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰凝乳蛋白酶＞胰蛋白酶，富硒和未富硒螺旋藻總蛋白的酶水解多肽SeSP-Ps和SP-Ps對ACE的抑制作用具有相似的趨勢，且SeSP-Ps對ACE的抑制率均高于SP-Ps，其中胃蛋白酶水解多肽SeSP-Ps對ACE的抑制率明顯高于SP-Ps (P＜0.05)。結果還發現，胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯合水解的SeSP-Ps對ACE抑制率最高(89.5%)，明顯高于相同酶解條件下的水解多肽SP-Ps對ACE的抑制率(72.2%)。結果表明蛋白酶水解多肽對ACE抑制率與上述結果中的水解度相一致，胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯合水解，較好地模擬了人體消化道酶系統，提示SeSP-TP經人體消化利用后，可產生對ACE具有較強抑制作用的活性多肽。因此，SeSP作為防治高血壓和心腦血管的保健食品具有廣闊的應用前景。

2.4 SeSP-Ps抑制ACE的劑量效應

圖4 胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯合水解多肽抑制ACE的劑量效應關系Fig.4 Dose dependence of ACE inhibition activity of SeSP-Ps hydrolysate obtained by the combined use of pepsin, trypsin and chimotrypsin

從圖4可見，胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯合水解的SeSP-Ps對ACE的抑制具有明顯的劑量效應關系，推算SP-Ps和SeSP-Ps的IC50值分別是139.8μg/mL和74.6μg/mL，差異明顯。當多肽質量濃度在200μg/mL以下時，SP-Ps和SeSP-Ps對ACE抑制效率差異不顯著，而當多肽質量濃度高于200μg/mL時，SP-Ps和SeSP-Ps的ACE抑制效率差異極顯著(P＜0.01)。另外，用ICPAES測定SeSP-TP和SeSP-Ps中Se含量分別為314μg/g和293μg/g，兩者差別較小。結果說明，在SeSP-Ps制備過程中硒的損失不大；另外，當多肽質量濃度小于200μg/mL時，其中所含Se的質量濃度為0.06μg/mL，可能很難發揮其作用，造成SP-Ps和SeSP-Ps的ACE抑制效率差異很小。隨著SeSP-Ps質量濃度的增加，Se含量也隨之上升，Se則可能參與對ACE的抑制作用，導致SeSP-Ps在高濃度時對ACE的抑制效率顯著高于SP-Ps。

3 結 論

研究了5種蛋白酶水解SeSP-TP的效率及其水解多肽對ACE的抑制作用，并進一步探討了最優酶解方案的水解多肽抑制ACE的劑量效應和IC50值。結果發現采用模擬人體內消化道胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯合水解方案對SeSP的水解度最高，其水解多肽SeSP-Ps對ACE的抑制最強，IC50值為74.6μg/mL，SeSP-Ps對ACE的抑制作用呈現顯著的劑量-效應依賴性。

[1] 王文博, 高俊萍, 孫建光, 等. 螺旋藻的營養保健價值及其在預防醫學中的應用[J]. 中國食物與營養, 2009(1): 48-51.

[2] 吳文龍, 楊志娟. 螺旋藻保健食品的功能因子與研究開發進展[J]. 食品研究與開發, 2006, 27(2): 129-131.

[3] CHEN Tianfeng, ZHENG Wenjie, WONG Y S, et al. Accumulation of selenium in mixotrophic culture of Spirulina platensis on glucose[J]. Bioresource Technology, 2006, 97(18): 2260-2265.

[4] MENDIOLA J A, JAIME L, SANTOYO S, et al. Screening of functional compounds in supercritical fluid extracts from Spirulina platensis[J]. Food Chemistry, 2007, 102(4): 1357-1367.

[5] 黃峙, 鄭文杰, 向軍儉, 等. 含硒藻藍蛋白抗小鼠實驗性肝損傷的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2002, 18(7): 819-822.

[6] HUANG Zhi, GUO Baojiang, WONG R N S, et al. Characterization and antioxidant activity of selenium-containing phycocyanin isolated from Spirulina platensis[J]. Food Chemistry, 2007, 100(3): 1137-1143.

[7] 彭赟, 黃峙, 郭寶江. 富硒螺旋藻清除氧自由基的初步研究[J]. 營養學報, 2005, 27(1): 61-64

[8] 黃峙, 楊芳, 鄭文杰. 富硒螺旋藻中硒別藻藍蛋白的純化及其特性[J]. 微生物學報, 2006, 46(3): 401-405.

[9] HUANG Zhi, YANG Fang, ZHENG Wenjie, et al. Purification and preparation of active subunits of C-phycocyanin by a protocol of liquidphase isoeletric focusing[J]. Chemical Journal of Chinese Universities, 2006, 27(6): 1051-1054.

[10] HUANG Zhi, ZHENG Wenjie, YANG Fang, et al. Chemical composition and selenium distribution in selenium enriched Spirulina platensis biomass[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2006, 42(6): 636-640.

[11] MEGIAS C, PEDROCHE J, YUST M, et al. Purification of angiotensinconverting enzyme inhibitory peptides from sunflower protein hydrolysates by reverse-phase chromatography following affinity purification[J]. LWT - Food Science and Technology, 2009, 42(1): 228-232.

[12] CHEUNG I W Y, NAKAYAMA S, HSU M N K, et al. Angiotensin-I converting enzyme inhibitory activity of hydrolysates from oat (Avena sativa) proteins by in silico and in vitro analyses[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(19): 9234-9242.

[13] GUANG C, PHILLIPS R D. Purification, activity and sequence of angiotensinⅠconverting enzyme inhibitory peptide from alcalase hydrolysate of peanut flour[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(21): 10102-10106.

[14] SHEIH I C, FANG T J, WU T K. Isolation and characterisation of a novel angiotensin Ⅰ-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from the algae protein waste[J]. Food Chemistry, 2009, 115(1): 279-284.

[15] 黃峙, 向軍儉, 鄭文杰, 等. 鈍頂螺旋藻富集轉化硒及硒在藻體中的分布[J]. 植物生理學通訊, 2001, 37(1): 12-14.

Angiotensin Convert Enzyme Inhibition of Peptides Derived from Water Soluble Total Protein of Selenium-enriched Spirulina platensis

GAO Dong-fang，ZHANG Yi-bo，LING Qin-jie，ZOU Ying，HUANG Zhi*
(College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

The water soluble total protein (TP) of selenium-enriched Spirulina platensis (SeSP), named as SeSP-TP, was extracted by phosphate buffer and then hydrolyzed by 5 different proteases to produce SeSP peptides (SeSP-Ps). The angiotensin convert enzyme (ACE) inhibition of SeSP-Ps was measured in vitro. The results showed that treatments with different proteases caused obvious difference of hydrolysis degree (HD) to SeSP-TP, and the combined use of pepsin, trypsin and chimotrypsin led to the highest H. Furthermore, we found that all SeSP-Ps produced by various proteases could inhibit ACE. The 50% ACE inhibition concentration (IC50) of SeSP-Ps derived from the combination of pepsin, trypsin and chimotrypsin was 74.6μg/mL, which was the lowest in comparison with SeSP-Ps obtained with each of the three enzymes or papain. The present results implied that the excellent functional food SeSP contains highly active dose-dependent ACE inhibition peptides.

angiotensin convert enzyme；Spirulina platensis；selenium；peptide

TS201.6

A

1002-6630(2011)07-0007-04

2010-07-04

國家自然科學基金項目(20975045；20675045)；暨南大學大學生創新工程項目(cx10088)

高冬芳(1988—)，女，本科生，研究方向為天然產物抗高血壓活性。E-mail：2007051587@stu.jnu.edu.cn

*通信作者：黃峙(1968—)，男，副教授，博士，研究方向為砷、硒等元素的活性形態及其作用機制。

E-mail：thsh@jnu.edu.cn