動物組織線粒體DNA研究進展

樊賀明 楊明妍 畢峰

線粒體基因組也叫線粒體DNA(mtDNA，Mitochondrial DNA)，結構與細菌DNA相似，呈雙鏈環狀，可獨立編碼一些蛋白質，是核外遺傳物質，人們在線粒體中已發現RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖體等全套裝備，說明線粒體具有獨立的遺傳體系。

1 mtDNA的構成

mtDNA分子為環狀雙鏈DNA分子，外環為重鏈（H），內環為輕鏈（L）。基因排列非常緊湊，除與mtDNA復制及轉錄有關的一小段區域外，無內含子序列。每個線粒體含數個mtDNA，動物組織mtDNA約16～20kb，大多數基因由H鏈轉錄，包括2個rRNA，14個tRNA和12個編碼多肽的mRNA，L鏈編碼另外8個tRNA和一條多肽鏈。mtDNA上的基因相互連接或僅間隔幾個核苷酸序列，一些多肽基因相互重疊，幾乎所有閱讀框都缺少非翻譯區域。很多基因沒有完整的終止密碼，而僅以T或TA結尾，mRNA的終止信號是在轉錄后加工時加上去的。

2 mtDNA的組成特點

mtDNA是一共價閉合的雙鏈環狀遺傳物質,具有分子量小、結構簡單、易于分離、拷貝數高、突變率高、進化速度快、母性遺傳、無組織特異性等特點。其分子大小在14～42kb之間，絕大多數介于16～18kb,mtDNA已被廣泛應用于發病機理、臨床診斷、遺傳變異、生物進化等多方面的研究，并已在分類學、種系鑒定、遺傳學、進化論等領域取得一定的成就[1]。對大量不同動物(包括人在內的13種哺乳動物、2種鳥類、2種兩棲類、6種魚類、4種爬行類、6種昆蟲類等) 線粒體基因組全序列測定表明, 動物線粒體基因由大致為15～20kb的雙鏈環狀DNA分子組成。雙鏈3′端是一段具有二級結構的高保守性控制區,控制線粒體DNA的復制和轉錄。這一區域多是串聯重復序列，并在核DNA上有同源區。它與轉座、錯配表達和線粒體基因異質(heteroplasmy)相關[2-3]。

3 mtDNA的結構特點

mtDNA結構基因排列緊湊,幾乎沒有間隙序列和內含子。在編碼脯氨酸和苯丙氨酸tRNA的基因之間,由少數堿基構成一個突出結構—D環,它由與輕鏈互補的一小段DNA合成,并在這一區域取代了重鏈。D環是mtDNA與細胞核相聯絡的重要區域,也是mtDNA復制與轉錄的關鍵部位。該區在人、鼠、豬的mtDNA中是相當保守的,可形成一種發夾樣次級結構。這一結構可與線粒體引發酶、γ-DNA-多聚酶和線粒體拓外異物酶Ⅰ和Ⅱ等強烈結合[4]。

4 mtDNA 的制備方法

mtDNA制備方法是國內外研究的熱點，目前已有較多報道，可分為：超速離心法、差速離心法、堿裂解法和柱層析法。現將國內外幾種較好的提取組織線粒體DNA的方法進行比較[5]。

4.1 非離子型去污劑法

戴紀剛等利用非離子型去污劑TrionX-100能溶解除核膜以外的所有細胞膜的特點，建立了一種通過核質分離技術制備mtDNA的方法。通過適當的離心，分離細胞核/細胞質來獲取mtDNA。其主要優點是不需要分離細胞的總DNA，也不需要分離和純化細胞線粒體，而是從完整細胞直接分離mtDNA，方法簡單快速，對實驗設備和試劑要求不高，一般實驗室均可應用。由此可見，本方法制備mtDNA完全可以滿足常規的研究工作的需要。

4.2 差速離心法

朱克軍等[6]以差速離心法分離線粒體,用堿性SDS法裂解線粒體膜,釋放線粒體DNA后用酚/氯仿抽提,TE或ddH2O溶解，然后將所得線粒體DNA進行純度鑒定，并和其他方法制備的線粒體DNA經PCR進行擴增,比較擴增效果。

4.3 密度梯度離心法

密度梯度離心法純化DNA是一種廣泛應用的方法，其突出優點是獲得的DNA純度高。但經典的等密度梯度離心法的離心時間需要48～60h，實驗周期長，儀器損耗大，對于電壓不穩的實驗室，這個問題還直接危及儀器的安全，而且，DNA樣品長時間暴露在高濃度的鹽(如CoCI)溶液中，容易受損傷。徐秀英等[7]采用兩級梯度離心法純化DNA，離心時間只需5h，離心效果與48h經典的密度梯度離心法無明顯差別，達到了快速純化的目的。

4.4 堿裂解法

堿裂解法，即SDS堿裂解法。其主要原理是通過使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質變性，相互纏繞成大型復合物，被十二烷基磺酸鈉包蓋，當用鉀離子取代鈉離子時，復合物會從溶液中有效沉淀下來，離心后即可從上清中回收質粒DNA。(1)Tamura等[8]通過改進提取質粒DNA的堿裂解法來提取線粒體DNA,優點是簡便快捷，缺點是微量制備，如果要檢測大量個體，堿裂解法就會顯得非常麻煩和費時。(2)劉麗紅等[9]提出了一種直接以組織細胞制備mtDNA的技術方法，其優點:①對實驗設備和試劑要求不高,一般實驗室均可應用。②該方法對標本要求不高，-70℃冰凍保存或液氮保存即可。③mtDNA產率有極大提高,mtDNA樣品紫外分光光度檢測結果表明,每克組織可獲得約8μg mtDNA。④不需要分離細胞的總DNA，也不需要分離和純化細胞線粒體,而是從完整細胞直接分離mtDNA。因此,本方法簡便快速,僅需2～3h,重復性好。⑤本方法尤其適用于標本量少,經費不足時mtDNA模板的制備。⑥用本方法所得mtDNA樣品純度高。

4.5 柱層析法

層析分離技術是一種物理的分離方法、它利用混合物中的各組分物理化學性質的差別（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數等），各組分以不同程度分布在兩相中，從而使各組分以不同速度移動而達到分離。柱層析法是利用各分子形狀和大小不同，在層析柱中的流速不同而將各組分分離。此方法操作簡單，效果好，重復性高，應用廣泛。常用于線粒體分離[10]。

人類及絕大多數哺乳動物細胞mtDNA都是閉環雙鏈DNA分子。動物組織線粒體DNA的提取方法依其動物本身組織的不同特點，從方法學研究角度看,對新鮮動物線粒體DNA提取分離方法常用的有酚氯仿萃取、乙醇沉淀、CsC1超速離心、酸性緩沖液、堿性緩沖液等[11]。而對中藥材來說,DNA一般因加工、干燥、儲藏等過程部分降解同時易受到細胞中抑制PCR的蛋白質、多糖類、多酚類成分的影響,在提取DNA時加入SDS等蛋白質變性劑,在PCR時加入小牛血清蛋白(BSA)以滅活內源性核糖酶,排除干擾PCR的色素物質[12-13]。

分子遺傳學標記技術為中藥材與易混品種的鑒別提供了一條新的途徑[14]。線粒體DNA（mtDNA）作為遺傳信息的載體，是研究動物起源進化及對群體進行遺傳分析的理想對象，線粒體細胞色素b[15-16]（cytb）基因進化速度適中，是分析種內、種間遺傳多樣性和進化關系的適當DNA片段，可應用于生物的分類、系統發育和遺傳多樣性的研究[17]。

5 應用前景

我國雖有豐富的中草藥資源，但由于缺乏系統的整理和歸類，致使中藥材同名異物、同物異名的現象屢有發生；中藥商品市場混亂，多有以假充真、以次充好的情況；隨著人們“回歸自然”迫切需求，中藥需求量的日益擴大，資源矛盾日趨尖銳。而解決這些問題的關鍵是要有一套簡便快速、準確有效的鑒別中藥材正品的技術與方法，以杜絕假、劣及混淆品的干擾；找出形成質量優、產量高的道地藥材的機制，明確其生長條件，以培育出更多優質的重要原材料；對于珍稀、瀕危動植物，則需要大力保護，積極尋找替代品，或根據習性進行人工栽培和繁殖[18]。

目前，分子生物學技術已成為中藥DNA指紋圖譜鑒定的一項主要技術，DNA分子標記技術在中藥鑒定和質量檢測方面均有其獨到的優勢和廣闊的應用前景，但仍需完善[19]。而動物mtDNA的研究已廣泛滲透到保護生物學、系統學、分類學等學科中。早期的mtDNA的研究主要集中于限制性片段長度多態性分析（RFLP），近年來，隨著DNA測序技術的成熟和普及，mtDNA的研究不斷深入，應用日趨廣泛[20]。

總之，DNA指紋圖譜技術具有快速、微量、特異性強等特點，且不受生長發育階段、供應部位、環境條件的影響，已在中藥鑒定學研究中展示了良好的應用前景，并保持了強勁的發展勢頭[21]。

[1] 戴紀剛,吳宇,魏泓,等.一種簡單快速制備動物線粒體DNA的方法[J].第三軍醫大學學報,2000,22(4):391-392.

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[6] 朱克軍,汪振誠,王學敏,等.一種改進的提取人外周血和組織線粒體DNA的方法[J].第二軍醫大學學報,2004,25(04):444-446.

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[8] Tumura K, T Aotsuka. Rapid Isolation Method of Animal mitoc-hondrial DNA by the Alkaline lysis procedure[J].Biochem Genct,1988,26(11-12):815-819.

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