腸道病毒及其實驗室診斷概況

秦劍秋 (廣西壯族自治區南寧市疾病預防控制中心,廣西南寧530011)

近幾年,隨著手足口病疫情日益為政府及大眾所重視,其病原體腸道病毒 (Enterovirus,EV)也成為廣大疾控工作者的工作重點。腸道病毒血清型眾多,一種綜合征可由不同病毒所引起,同一種(型)病毒可以導致不同綜合征,這是腸道病毒屬病毒感染的普遍現象。在腸道病毒的實驗室診斷方法中,傳統的病毒培養與血清中和試驗方法是金標準,但具有費時、繁瑣,且敏感性不高等局限性,而血清型多樣性又限制其血清學檢測方法的應用。分子生物學檢測技術的發展,為腸道病毒的診斷與分類提供了快速、準確的方法。

1 腸道病毒概況

腸道病毒是小RNA病毒科4屬成員中的一大屬病毒,人類EV共有70余個血清型。早期根據病毒在人或靈長類動物來源細胞上的復制能力,在不同動物種類上的感染性、致病性和抗原差異性,將人EV分為脊髓灰質炎 (脊灰)病毒 (Poliovirus,PV Ⅰ～ Ⅲ型)、柯薩奇 (Coxsackie)病毒A組和B組(CAV1～22和24型、CBV1～6型)、埃柯病毒 (Echovirus,ECV1～7、9、11～27、29～33型)。鑒于這種分類在一定程度上受到可應用細胞系和自然情況下EV固有生物表現型變異等情況的限制,自1970年起,新鑒定的血清型不再歸入以上組別,而以數字編碼命名為EV68～71型[1]。隨著分子生物學技術與生物信息學方法的應用,新血清型病毒不斷被鑒定,至今已報道的新病毒編碼到EV111[2-4]。根據生物學及遺傳特性將其分為4個組 (species):CAV2、3、5、7、8、10、14、16和EV71組成A組;所有CBV、ECV血清型、CAV9和EV69組成B組;PV 3種血清型,CAV1、11、13、17、18、20、21、24組成C組;EV68、70組成D組[5-7]。也有將PV3種血清型另列為一組,分為5組[8]。

EV因寄居腸道而得名,其共同特點為:病毒呈圓球狀顆粒,呈現20面體,立體對稱,病毒顆粒裸露,無囊膜。病毒含有一個單股正鏈RNA分子,大小約7～8kb。主要衣殼蛋白有1A、1B、1C、1D,通常分別稱為VP4、VP2、VP3、VP1。腸道病毒可引發多種感染,情況較為復雜。主要包括急性呼吸道疾病、無菌性腦膜炎、腦膜腦炎、心肌炎、手足口病、新生兒多器官衰竭和急性弛緩性麻痹(AFP)[9]等。其發病多以綜合征出現,嬰幼兒患者可引發嚴重心肌炎或重癥肺炎,而導致死亡。近幾年引起大眾關注的主要還是腸道病毒所致的手足口病疫情。2008年～2010年7月,中國大陸出現Cox-A16和EV71共循環引起手足口病爆發,部分地區以EV71為絕對優勢型別,少數以CoxA16為優勢型別[10]。腸道病毒感染臨床表現多樣化,一種綜合征可由不同病毒單獨或共同引起,同一種 (型)病毒可以導致不同綜合征,這是腸道病毒屬病毒感染的普遍現象。而某種癥狀也常由多種血清型的腸道病毒引起,如小兒麻痹癥就是脊髓灰質炎病毒與腸道病毒其他血清型共同作用的結果[11-12]。因而從公共衛生的角度,對病原體進行實驗室診斷十分必要。只有對病原體進行實驗室診斷,才能在一次疾病的爆發或流行中確定各病例間的流行病學關聯,進而確定EV特異血清型的病原譜。

2 腸道病毒診斷方法

2.1 病毒分離與血清中和試驗

利用組織培養技術從感染部位或傳染源分離出病毒并鑒定其特異性血清型是病毒性疾病診斷的金標準。病人糞便標本是最常采集的標本,其他如咽拭子、腦膜炎患者的腦脊液、心包炎患者的心包積液、手足口病患者的皰內滲出液、結膜炎患者的眼部分泌物等都是常用分離病原的標本。EV常用接種細胞系有:猴腎細胞系 (I I C-MK2)、人肺細胞系 (MRC-5)、人橫紋肌肉瘤系 (RD)、非洲綠猴腎細胞系(Vero)和人肺癌細胞系 (A549)等[13]。

病毒接種后經過培養,可以利用電子顯微鏡進行觀察鑒定。一般來說,腸道病毒型特異性鑒定主要靠血清中和試驗。在病毒分離基礎上,應用組合血清和/或型特異性血清進行中和試驗來定型分類。因在實踐中不可能用70多個型特異性抗血清進行逐一中和,所以發展了超免疫組合血清進行初步定型,再用特異單型抗血清證實。目前常用的Lim Benyesh Melnick(LBM)組合血清 (A～H)可鑒別42個型EV[14](包括ECV22、23)。如果未鑒定成功,可再用另外含19個型CAV抗體組合 (J～P)進行鑒定[15]。另一種組合血清是目前世界衛生組織 (WHO)推薦脊灰實驗室應用的RIVM組合血清,它還可對EV68～71型進行鑒定[16]。但中和時常遇到無法定型的病毒株,主要原因有[17]:①2種及以上型別混合感染。由于EV不同型別的混合感染發生率較高,可在定型前通過對分離物進行空斑形成試驗或3′系列終末稀釋傳代進行純化;②組合血清未包含所有血清型,如運用LBM組合血清,CAV3、11、15、17、24和EV68～71型就無法鑒定;③EV有時會聚集在一起,必須通過脫氧膽酸鈉或氯仿或超濾處理,使其分散后才能進行鑒定;④可能由于抗原變異與標準株抗血清不產生中和反應;⑤確實是新型別無法定型。

病毒培養對縮短抗生素治療和住院期有積極作用,其定型診斷對流行病分析有重要意義。但是,病毒的分離鑒定繁瑣、費力、耗時,一般需要1周甚至更長的時間才能觀察到細胞病理反應 (CPE),不能滿足疫情處置對時間的要求。而根據細胞病理反應無法確定病毒的類型,同時費用高、敏感性低,檢測結果受主觀因素干擾較大,并需要較高的專業知識及實驗室設備。更重要的是許多腸道病毒不能進行細胞培養,或者可以培養但不出現細胞病理效應,如柯薩奇A組病毒,往往貽誤特異性治療。同時對診斷某些腸道病毒血清型和腦膜炎的敏感性也欠佳,給臨床診斷和快速檢測工作帶來困難和挑戰[18]。

2.2 血清學檢測

人體感染腸道病毒后,可產生3種特異性抗體:IgA,由唾液及腸道局部產生;血清中受染后1～3d可出現IgM,提示為新近感染,中和抗體可維持數周;IgG主要為IgG1和IgG2 2個亞型,具有較持久性特異性免疫力,提示為既往感染。血清學試驗主要是酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)、中和試驗、血凝抑制試驗、補體結合試驗、免疫熒光試驗等方法檢測這些抗體。利用酶聯免疫吸附試驗捕捉法或間接法檢測早期病人血清中的IgM和IgG抗體,是較常用的檢測指標,尤其以柯薩奇B組病毒的感染診斷較多。另外,病毒抗原還可從心、腦、脾、胰、肝和胸腺等多器官檢出。在暴發疫情的腸道病毒血清學鑒定中,一般單份血清IgM抗體效價無意義,因為健康人血清中IgM抗體都有一定效價,易造成誤判;雙份血清檢測IgG抗體,恢復期抗體效價呈4倍以上升高,才具診斷意義。由于,第二份血清采集時間比第一份至少延后1～2周時間,得到明確診斷需至少1周以上時間。因此該方法在檢測中不適用于暴發疫情的早期診斷,可作為回顧性調查手段之一;同時因腸道病毒血清型別眾多,臨床使用檢測價值有限,而多為流行病學采用[18]。

2.3 分子生物學方法

隨著分子生物學技術的發展,EV診斷鑒定方法已從血清學分析轉向遺傳學分析。基于RT-PCR方法的EV診斷技術是目前靈敏度最高的RNA檢測技術[19],它以RNA為模板逆轉錄成互補DNA(cDNA)的第一條鏈,再以該鏈為模板進行PCR反應,由此可以檢測出單個細胞中少于10個拷貝的特異的RNA。RT-PCR技術克服了傳統方法檢測靈敏度低、操作繁瑣的缺點,PCR檢測一般可在收到標本后2～5h內提供診斷結果,是目前較理想的診斷技術[20-22],已在醫學和生物學領域內得到了廣泛應用。

早期大多數研究都采用針對5'NCR的RT-PCR,然后進行核苷酸測序。雖然不能用于分型鑒定,但由于5'NCR編碼HEV基因組的一段保守序列,比較易于設計引物,可以用于EV的RT-PCR初步篩查。根據VP1全序列對EV的遺傳學分類與第7次國際病毒分類委員會 (ICTV)通過的分類結果完全一致,但應用RT-PCR和測序技術測定VP1部分序列對EV進行分型鑒定僅能鑒定42個原型株。這可能是因為各血清型中引物序列的高度多樣性所致的引物特異性低造成的。對不能定型的EV至少要用5套簡并引物擴增VP1全序列,而且少數分離株也難以擴增。Caro等[23]又在VP1和2C設計了一套引物擴增所有HEV的原型株,但仍不能擴增CAV5、19、22型等在乳鼠增殖的原型株,以及EV68型和EV70型原型株。在將EV分成亞組方面VP4序列定型方法不如VP1序列敏感,但VP4序列定型法中使用的引物能擴增所有的EV原型株,而且引物序列比較保守,能擴增30a間在不同地區收集的26個血清型的89株EV。隨著分子生物學技術的發展,Hiroaki等[24]建立了應用HEV衣殼蛋白VP4的207個核苷酸序列的種系發生樹進行分子診斷的方法。

新近發展的RT-PCR技術,利用PCR對DNA的高效擴增,探針技術的高特異性和光譜技術的高靈敏性的特點,不僅克服了常規PCR檢測的不足,并且具有直觀、重復性好、靈敏性高和易操作等特點[25],逐漸應用于常規腸道病毒的實驗室診斷。由于近年手足口病疫情的進一步發展,國內多家實驗室都自行研發了用于手足口病實驗室診斷的EV71及CoxA16的引物探針,使得這一技術在疫情的處置上充分發揮了作用。

在PCR作為診斷技術主流的同時,建立在核酸基礎上的新一代診斷技術正在形成,如檢測遺傳物質的環介導擴增技術 (LAMP)和基因芯片技術。環介導擴增技術 (LAMP)是一項比PCR更具活力的方法,它需要便宜簡單的儀器,在野外就可以使用這種方法。基于該特點,國內已有人建立了適于腸道病毒現場或臨床檢測的快速方法[26]。核酸芯片技術用單一操作可以檢測數百種或數千種病原/菌株,具有高通量、靈敏度高、特異性強和檢測時間短等優點,因此特別適合用于腸道病毒的實驗室診斷。目前,我國崔倫標等[27]建立的液相芯片檢測方法正是基于該技術并成功應用于手足口病的病原檢測。

3 結語

腸道病毒作為一種古老的病毒已經與人類共同存在了數千年,隨著脊髓灰質炎被消滅后,這一屬病毒中最引人注目的當是引起手足口病的柯薩奇病毒及新腸道病毒 (以71型為主)。由于這些病毒的易變性,目前尚無疫苗可防。而這些年來手足口病疫情勢頭不減,給防控工作帶來了難度。為此,快速準確的分子生物學檢測實驗室診斷技術是應對突發的手足口病疫情的有效的技術手段。針對其血清型別眾多的特點,基于基因芯片技術的高通量的檢測將是腸道病毒分子生物學檢測技術今后發展的主要方向。

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