曲酸遺傳毒性的研究

陳永紅，黃夏寧，鄒志飛，谷康定，王 嵐，劉慧智

曲酸遺傳毒性的研究

陳永紅1，黃夏寧2，鄒志飛1，谷康定2，王 嵐1，劉慧智1

(1.廣東檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623；2.華中科技大學同濟醫學院公共衛生學院，湖北 武漢 430030)

目的：研究曲酸遺傳毒性及有關作用機制。 方法：采用小鼠骨髓細胞微核實驗檢測染色體損傷。用不同質量濃度曲酸(0、500、1000、1500、2000、2500μg/mL)誘導CHO-K1細胞，單細胞凝膠電泳實驗檢測CHO-K1細胞DNA損傷。 結果：1/2 LD50、1/4 LD50和1/8 LD50不同劑量曲酸誘導昆明小鼠微核實驗結果顯示，各質量濃度受試組與陰性對照組差別無顯著性。單細胞凝膠電泳結果顯示：曲酸作用質量濃度為 1000μg/mL，作用時間為6h時，即出現輕微DNA損傷；當曲酸作用質量濃度增大到2500μg/mL時，出現明顯的DNA損傷。在24h內，或其他同一作用時間段，隨著曲酸作用質量濃度增加，DNA損傷也呈增加趨勢。實驗未發現有明顯的時間-效應關系。結論：體內小鼠骨髓細胞微核實驗未觀察到曲酸明顯的遺傳毒性，但體外實驗高質量濃度曲酸在一定時間可導致DNA損傷。

曲酸；傳代細胞株；微核實驗；單細胞凝膠電泳

曲酸作為一種皮膚增白劑、食品添加劑、抗菌殺蟲劑和皮膚病治療劑，獲得廣泛應用。最近，有關曲酸可能引起肝臟、甲狀腺損害，甚至導致腫瘤發生的實驗研究結果，引起了人們的不安[1-4]。國外早期雖然比較詳細研究了曲酸的毒性和機制，并認為其相對安全，但是有關最新的遺傳毒性、致畸、致癌實驗等結果和毒性機制，則動搖了原有的認識。人們對待曲酸的安全性仍然存在很多疑問、混淆和不解之處，有關曲酸毒性機制更深入、更本質的研究從來沒有停止。本研究以曲酸為受試物，以昆明種小鼠為體內實驗研究對象，CHO-K1細胞為體外實驗研究對象，考察曲酸對上述不同生物體系的遺傳毒性和可能作用機制，為系統研究曲酸的安全性、闡述其毒性機制提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

健康SPF昆明小鼠購自華中科技大學同濟醫學院醫學實驗動物中心。實驗前1周購買并妥善喂養，觀察小鼠健康狀態；CHO-K1細胞 華中科技大學同濟醫學院免疫學教研室。

曲酸(kojic acid) 美國Sigma 公司；1640培養基 美國Gibco公司；環磷酰胺 美國Alfa公司。姬姆薩(Giemsa)染料、羧甲基纖維素鈉 國藥集團化學試劑有限公司；低熔點瓊脂糖 美國Promega公司；其他化學試劑均為分析純。

BX51TF熒光顯微鏡 日本Olympus公司；DYY6C雙穩定時電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓細胞微核實驗

參照參考文獻[5]。取7～12周齡，體質量25～30g小鼠，雌雄各25只。隨機分組，每組用兩種性別動物至少各5只。受試物設3個劑量組，最高劑量組取1/2 LD50(LD50=5100mg/kg，以體質量計)，分別取1/4LD50和1/8LD50，作為中、低劑量組。實驗共分為5組：陰性對照組(質量濃度5mg/mL羧甲基纖維素鈉)、陽性對照組(6mg/mL 環磷酰胺)、高劑量組(1/2LD50，5mg/mL羧甲基纖維素鈉配制127.5mg/mL曲酸溶液)、中劑量組(1/4 LD50，5mg/mL羧甲基纖維素鈉配制63.75mg/mL曲酸)、低劑量組(1/8LD50，5mg/mL羧甲基纖維素鈉配制31.875mg/mL曲酸)。

各組溶液均按0.2mL/10g灌胃。染毒途徑和方式：經口灌胃，采用30h兩次給藥法，即兩次給受試物間隔24h，第二次給受試物后6h取材。取胸骨骨髓涂片、染色、觀察計數。

用雙盲法閱片。每只小鼠計數1000個嗜多染紅細胞，觀察含有微核的嗜多染紅細胞數，微核率以千分率表示。

觀察嗜多染紅細胞(PCE)與成熟紅細胞(RBC)比值，可作為細胞毒性指標之一。一般計數200個紅細胞。

1.2.2 堿性單細胞凝膠電泳

CHO-K1細胞復蘇：從液氮罐中取出凍存的CHO-K1細胞，置40℃迅速融化，將細胞液轉入離心管加無血清培養基，1000r/min離心2min。去上清液，加入適量10% 1640完全培養基，吹散細胞后計數，按適合密度轉入細胞培養瓶，放入37℃細胞培養箱培養4h，然后棄去上清液加入新的完全培養基。

CHO-K1細胞培養：待CHO-K1細胞達到對數生長期時，收獲細胞。倒去培養瓶中培養基，3mL D-Hank’s溶液潤洗細胞1次，倒去溶液，1mL 0.25%胰酶消化細胞1.5min，倒去溶液，加入10mL 10%血清RPMI 1640完全培養基終止消化，用吸管輕輕將培養瓶壁上的細胞吹下，輕輕吹打混勻，于6孔細胞培養板中接種細胞，至少接種4板。

CHO-K1細胞染毒：細胞在6孔培養板培養24h后，按曲酸終質量濃度為0、500、1000、1500、2000、2500 μg/mL染毒，分別培養6、12、24、48h后投入后續實驗。

堿性單細胞凝膠電泳：吸棄6孔細胞培養板原培養液后，用2mL D-Hank’s 潤洗細胞，0.25%胰酶分散細胞，每孔加1mL 10%血清1640 培養液終止消化，轉移細胞懸液至另一EP管，計數每孔細胞數，保證每管100000個細胞(1mL)。4℃、1400r/min低溫離心5min，輕輕移去上清液，重復懸浮、離心一次，再定容為1mL細胞懸液。3層瓊脂糖制片，其中取10μL細胞懸液與75μL(0.7%)低熔點瓊脂糖混勻鋪片，4℃裂解1.5h，4℃解旋20min，電泳25min(25V，300mA)，溴乙啶(EB)熒光染色、觀察、拍照和分析。每個樣本隨機選擇100個細胞，圖片保存后，用CASP彗星圖像軟件分析結果。

1.2.3 統計方法

使用SPSS統計軟件包進行統計分析。微核統計學分析采用Dunnett t檢驗。

2 結果與分析

2.1 遺傳毒性

2.1.1 曲酸誘導小鼠骨髓細胞微核效應

表1為不同劑量曲酸誘導小鼠骨髓細胞微核結果，將陽性對照組、曲酸各受試組與陰性對照組比較，Dunnett法t檢驗顯示，陽性對照組與陰性對照組存在極顯著性差異，而1/2LD50、1/4LD50和1/8LD50曲酸各受試組與陰性對照組無顯著性差異，雄性1/2LD50組與其他兩組曲酸結果比較稍有偏高，但沒有明顯劑量-反應關系。

表1 曲酸誘導小鼠骨髓細胞微核效果(x±s, n=10)Table 1 Induction of micronuclei in bone marrow of KM mice by kojic acid (x±s, n=10)

2.1.2 嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值(PCE/RBC)

將各組嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值(PCE/RBC)進行方差分析，觀察其毒性。表2和表3顯示各組之間差異無顯著性，表明各組小鼠未表現出細胞毒性。

表2 雄性小鼠PCE/RBC比值方差分析Table 2 Variance analysis for the ratio between polychromatic erythrocytes and normochromatic erythrocytes in male mice

表3 雌性小鼠PCE/RBC比值方差分析Table 3 Variance analysis for the ratio between polychromatic erythrocytes and normochromatic erythrocytes in female mice

2.2 DNA損傷測定結果

不同質量濃度曲酸作用CHO-K1細胞6h后，對受試細胞DNA損傷程度見圖1。曲酸質量濃度在1000μg/mL以上與對照組比較，DNA損傷程度逐漸緩慢增加，到2500μg/mL時出現劇烈增加。

圖1 曲酸作用CHO-K1細胞6h后細胞DNA損傷情況Fig.1 DNA damage induced by kojic acid in CHO-K1 cells after 6 h incubation

不同質量濃度曲酸作用CHO-K1細胞12h后，對受試細胞DNA損傷程度見圖2。曲酸質量濃度在1500μg/mL時與對照組比較，DNA損傷程度略有增加，到2500μg/mL時出現劇烈增加。

不同質量濃度曲酸作用CHO-K1細胞24h后，對受試細胞DNA損傷程度見圖3、4。曲酸質量濃度在1500 μg/mL以上與對照組比較，DNA損傷程度開始增加，到2000μg/mL以上出現劇烈增加。

圖2 曲酸作用CHO-K1 細胞12h后細胞DNA損傷情況Fig.2 DNA damage induced by kojic acid in CHO-K1 cells after 12 h incubation

圖3 曲酸作用CHO-K1細胞24h后細胞DNA損傷情況Fig.3 DNA damage induced by kojic acid in CHO-K1 cells after 24 h incubation

圖4 不同質量濃度曲酸作用CHO-K1細胞24h后的電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of CHO-K1 cells treated by kojic acid in various dosages for 24 h

圖5 曲酸作用CHO-K1細胞48h后細胞DNA損傷情況Fig.5 DNA damage induced by kojic acid in CHO-K1 cells after 48 h incubation

曲酸作用CHO-K1細胞48h后，對受試細胞DNA損傷程度在1000μg/mL以上與對照組比較，即開始明顯增加，到1500μg/mL出現劇烈增加，2000μg/mL和2500μg/mL損傷程度減緩，見圖5。

將各質量濃度曲酸作用下的Olive尾矩均數除以空白對照的Olive尾矩均數，得比值，綜合反映其關系，結果見圖6。曲酸質量濃度為2500μg/mL，作用6h時，DNA損傷變化最大。其他時間變化相對平和。

圖6 不同劑量曲酸在不同作用時間導致CHO-K1細胞DNA損傷趨勢Fig.6 Dynamic change rates of DNA damage induced by kojic acid in various treatment time and dosages in CHO-K1 cells

3 討 論

不同劑量曲酸誘導昆明種小鼠微核實驗結果顯示，各受試質量濃度組與陰性對照組差別無顯著性。雄性1/2LD50組與其他兩組曲酸結果比較稍有偏高，但沒有明顯劑量-反應關系。雌性小鼠各劑量組完全沒有劑量-反應關系，表明在本研究條件下，未觀察到曲酸對小鼠染色體損害。各組嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值(PCE/ RBC)經方差分析，各組之間差異無顯著性，表明各組小鼠未表現出細胞毒性。目前國內尚未見到與本研究相似報道，國外有報道[6-7]曲酸在兩套染色體畸變測試中具有致畸變效應，在一次姊妹染色單體交換實驗中為陽性。高質量濃度下，曲酸對體外測試系統Hep2G細胞微核致畸效應還不明了。曲酸單劑量或多劑量在一次體內骨髓微核實驗中，無染色體致畸作用。在轉基因小鼠基因突變測試中也未發現曲酸的致突變性。顯性致死實驗結果陰性表明曲酸不是生殖細胞致突變劑。唯一體內實驗結果陽性的是給藥后部分肝切除，用肝細胞進行的微核實驗。然而相關陽性結果是非常有限的。以上結果與本研究結果基本吻合，可能曲酸不是一種遺傳毒物。陽性組標準差偏高，原因系少數胸骨骨髓涂片微核數較高引起，根據經驗判斷，它對實驗結果的影響不大，如果時間、人力和成本允許，重復考察該陽性物環磷酰胺的結果可能更好。PCE/RBC為評價細胞毒性的指標，受試物各組該比值與陰性對照組比較若有統計學意義表示受試化學物劑量過大，實驗結果不可靠。如前所述，本研究各受試組和陽性組經檢驗與陰性組無統計學差別，也證明本實驗結果可靠。本研究不僅考察了曲酸對體內(in vivo)實驗對象的影響，還同時考察了曲酸對體外(in vitro)受試對象的作用過程。

彗星實驗是目前最為常用的體外檢驗DNA受損的方法。本研究結果顯示曲酸作用質量濃度為1000μg/mL，作用時間為6h時，即出現DNA損傷，但損傷較少，不明顯。當曲酸作用質量濃度增大到2500μg/mL，作用時間為6h時，與陰性對照組比較，出現明顯的DNA損傷。在24h內，各劑量組隨著作用時間的增加，DNA損傷呈增加趨勢。同一作用時間段，隨著曲酸質量濃度增加，DNA損傷也呈增加趨勢。曲酸作用48h，2000μg/mL及2500μg/mL劑量組與陰性對照組Olive尾矩(Olive Tail Moment)平均值之比出現下降趨勢。本實驗未發現有明顯的時間-效應關系。很多研究也已發現，動物在較長時間的毒素體內暴露后，DNA損傷的指標并沒有顯著升高，甚至呈現降低的趨勢。這可能是因為DNA損傷修復系統的激活和酶系統的反作用，或是由于隨著暴露時間的延長，DNA斷裂程度較高，以致在電泳時斷片可能丟失[8]。當然，體內、體外染毒方式的不同，各種動物的細胞對某種毒素的敏感度不同，將引起細胞損傷時間段和修復時間段的不同。國內目前主要是在部分化妝品中發現含有曲酸增白劑，質量濃度低于100μg/mL[9-10]，與本實驗結果比較，該質量濃度不至于導致DNA斷裂。而且曲酸通過皮膚轉移到血液的可能性非常小，因此尚不構成明顯危害。日本在各類食品中的添加量為0.05%～1%，國內尚未發現在食品中添加曲酸的報道。實驗中發現未染毒的對照組的少量細胞也出現了彗星拖尾，這可能是因為離開活體的細胞不可避免地會受到某些非生理條件的不利影響，如光線的照射等，導致了微量DNA在電泳中遷移。彗星圖像分析是單細胞凝膠電泳(SCGE)實驗不容忽視的一部分，所選分析指標影響SCGE的靈敏性。人工指標易受主觀因素干擾，而計算機圖像分析如CASP軟件[11]，可進行精細的熒光強度、尾矩、尾慣量等指標的測定。Olive尾矩(Olive尾矩：從頭光密度重心到尾光密度重心的距離與尾部 DNA含量的乘積)能更好地反映DNA損傷的程度。本研究采用Olive尾矩分析不同時間、不同質量濃度曲酸作用下單個細胞的DNA損傷程度，較傳統方法優越。

綜上所述，本研究體內實驗未觀察到曲酸明顯的遺傳毒性，但體外實驗高質量濃度曲酸在一定時間可導致DNA損傷，這種差異或者說是矛盾，是否因為DNA損傷在體內獲得修復而未表現出來？還是因為體內存在的代謝、轉化和結合等代謝途徑導致曲酸發生改變，使其不致產生遺傳毒性？或其他原因所致？值得深入研究和探討。

參考文獻：

[1]TAKIZAWA T, IMAI T, ONOSE J, et al. Enhancement of hepatocarcinogenesis by kojic acid in rat two-stage models after initiation with N-bis(2-hydroxypropyl)nitrosamine or N-diethylnitrosamine [J]. Toxicological Sciences, 2004, 81: 43-49.

[2]ISHIKAWA S, SASAKI Y F, KAWAGUCHI S, et al. Characterization of genotoxicity of kojic acid by mutagenicity in salmonella and micronucleus induction in rodent liver[J]. Genes and Environment, 2006, 28 (1): 31-37.

[3]WATANABE T, MORI T, KITAMURA Y, et al. Lack of initiating activity of kojic acid on hepatocarcinogenesis in F 344 rats[J]. Toxicol Pathol, 2005, 18: 79-84.

[4]NOHYNEK G J, KIRKLAND D, MARZIN D, et al. An assessment of the genotoxicity and human health risk of topical use of kojic acid [5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-4H-pyran-4-one][J]. Food Chemical Toxicology, 2004, 42: 93-105.

[5]中華人民共和國衛生部. GB 15193.5—2003骨髓細胞微核試驗[S].北京: 國家標準化管理委員會, 2003.

[6]LEE Y S, WEI C. Chromosomal aberrations in chinese hamster ovary cells induced by kojic acid[J]. Korean Soc Food Nutr, 1992, 21(4): 454-459.

[7]WEI C I, HUANG T S, FERNANDO S Y, et al. Mutagenicity studies of kojic acid[J]. Toxicol Letters, 1990, 59: 213-220.

[8]VANZELLA T P, MARTINEZ C B R, COLUS I M S. Genotoxic and mutagenic effects of diesel oil water soluble fraction on a neotropical fish species[J]. Mutation Research, 2007, 631: 36-43.

[9]CHENG S L, HUANG L R, SHEU J N, et al. Toxicogenomics of kojic acid on gene expression profiling of a375 human malignant melanoma cells[J]. Biol Pharm Bull, 2006, 29(4): 655-669.

[10]魏芳, 楊明, 郭德華, 等. 進口化妝品曲酸添加情況的調查[J]. 中國國境衛生檢疫雜志, 2007, 30(4): 106-108.

[11]KONCA K, LANKOFF A, BANASIK A, et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay[J]. Mutat Res, 2003, 534: 15-20.

Genetic Toxicity of Kojic Acid: Its Effects on Mice Mironucleus and DNA Damage in CHO-K1 Cells

CHEN Yong-hong1，HUANG Xia-ning2，ZOU Zhi-fei1，GU Kang-ding2，WANG Lan1，LIU Hui-zhi1
(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510623, China；2. School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

Objective: To investigate the genetic toxicity and its mechanisms of kojic acid. Methods: Bone marrow micronucleus test in mice and comet assay in CHO-K1 cells were used to examine DNA damage. KM mice were randomly divided into 5 groups for 5 males and 5 females in each group. The KM mice were administered with kojic acid at doses of 1/2, 1/4, and 1/8 fold LD50 for examining DNA damage. CHO-K1 cells were treated with kojic acid at the concentrations of 0, 500, 1000, 1500, 2000 μ g/mL and 2500μ g/mL for comet assay at 6, 12, 24 h and 48 h, respectively. Results: After treatment with kojic acid, the ratio of micronucleus in mice did not exhibit a significant increase, compared with the negative control. The slight DNA damage in CHO-K1 cells was observed in kojic acid group at the concentration of at 1000μ g/mL after 6 h incubation. Severely DNA damage was also observed when kojic acid concentration was increased to 2500μg/mL. However, no response-time relationship was observed. Conclusion: Kojic acid at the experimental conditions did not result in genetic toxicity in bone marrow cells of treated mice, but could induce DNA damage in vitro at high concentration level.

kojic acid；cell line；micronucleus test；comet assay

R114

A

1002-6630(2011)03-0228-05

2010-06-02

廣州市科技計劃項目(2007Z3-E0381)；廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目(2005GDK56)

陳永紅(1966—)，女，副主任技師，博士，主要從事進出口食品和化妝品的毒理學檢驗研究。E-mail：chenyh@iqtc.cn