人黑素細胞體外培養條件的研究進展

周梅華，魯 嚴

人黑素細胞體外培養條件的研究進展

周梅華，魯 嚴

從培養人黑素細胞的基本培養液、添加劑、紫外線以及共培養系統等方面綜述安全、有效的黑素細胞體外培養條件的研究進展；同時總結了人毛囊無色素性黑素細胞、永生化黑素細胞的培養條件，對色素疾病的基礎研究及臨床治療有重要意義。

黑素細胞；培養條件

[J Pract Dermatol, 2011, 4(1):30-33]

黑素細胞（melanocyte，MC）體外培養是研究黑素細胞增殖及黑素合成過程、揭示色素沉著異常及色素性疾病的病因、病理生理等的重要手段。黑素細胞體外培養的組織來源主要是人的表皮，常采用負壓吸引水皰法、淺表皮膚活檢術、包皮環切術等獲取[1,2]。取下的表皮可單獨或聯合使用胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、中性蛋白酶（Dispase Ⅱ）等進行消化[1-3]，獲得黑素細胞懸液，進行培養。近年來廣大學者在黑素細胞的體外培養條件方面不斷探索, 取得了一定的進展，現綜述如下。

1 黑素細胞的培養條件

1.1 黑素細胞基本培養液

黑素細胞的基本培養液主要提供黑素細胞生長的最低需求，包括改良Eagle培養基（dulbecco modifed eagle medium，DMEM）、Ham培養液、RPMI1640培養液等[2-4]。DMEM是在細胞生長最低必需培養基（minimum essential medium，MEM）的基礎上改良制成，適用于多種細胞系和組織的生長。Ham培養液包含Ham'F10 、Ham'F12，適用于細胞克隆化培養，其中F10適用于人二倍體細胞；F12在配方中添加了一定量的微量元素，可以在血清含量較少（2%～10%）的情況下培養細胞。RPMI1640培養基廣泛適用于黑素細胞在內的多種細胞的原代和繼代培養。

1.2 抑制成纖維細胞和角質形成細胞生長

抑制成纖維細胞和角質形成細胞生長是保障成功純化培養黑素細胞的先決條件。常用抑制劑有12-0-十四酰佛波醇l3-乙酸酯（TPA）+霍亂毒素（CT），抑制成纖維細胞和角質形成細胞貼附和生長，但由于TPA具有強致癌性，CT也是一種神經毒素，所培養黑素細胞的安全性受到質疑，臨床應用受到限制；還可以應用基因素（geneticin），選擇性去除快速增殖的成纖維細胞，Hu等[3]在黑素細胞培養基中加入100ug/ml的geneticin，5～7天污染的成纖維細胞全部被去除；此外國內有學者使用自制的抗角蛋白自身抗體（antikeratin auto antibody，AK auto Ab）可選擇性去除角質形成細胞。

1.3 添加劑作用

正常情況下，體外培養的黑素細胞生長緩慢、增殖能力弱，因此需要在黑素細胞培養基中添加各種因子以刺激黑素細胞增殖、分化及黑素形成，根據其作用可分為以下幾種。

1.3.1 促進黑素細胞的增殖和分化作用

TPA：TPA在黑素細胞體外培養中不僅能抑制成纖維細胞及角質形成細胞生長，還能促進黑素細胞的增殖和分化。二脂酰甘油/蛋白激酶C（DAG/PKC）信號轉導途徑在調節細胞增殖和生長的信號轉導中起重要作用。TPA可取代DAG活化PKC，刺激黑素細胞的增殖，增加樹突，促進黑素細胞的附著。1982年M Eisinger等在培養基中添加TPA、CT等，首次體外培養黑素細胞取得成功，這一方法后被許多學者采用。但由于TPA是強致癌劑，體內不易代謝。當用TPA慢性處理細胞時，可引起PKC持續活化、降解，最終使細胞內PKC耗竭，進而對外部抑制信號的反應性降低，細胞不斷地增殖，存在一定的致癌風險。因此限制了臨床應用。

CT和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）：環磷酸腺苷/蛋白激酶A （cAMP/PKA）信號轉導途徑在細胞的增殖和轉化中具有重要的調節作用。CT是PKA的激動劑，而IBMX為磷酸二酯酶抑制劑,減少細胞內cAMP分解。CT和IBMX通過不同方式激活cAMP/PKA途徑，提高細胞內cAMP的水平，促使黑素細胞分裂。Chen等[5]采用Hu16 培養基（在F12基本培養液中添加bFGF、IBMX、CT、FCS），獲得自體純黑素細胞懸液, 移植治療120例白癜風患者。由于CT是一種神經毒素,而IBMX不是人體自然存在物質，所培養的黑素細胞安全性受到質疑。

生長因子類：許多生長因子具有刺激受體型酪氨酸激酶的絲裂原活性，通過絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）級聯途徑，促進體外黑素細胞的大量增殖。

①堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）：bFGF是一種廣譜有絲分裂劑，可以刺激黑素細胞的生長,是黑素細胞的天然分裂劑。bFGF刺激絲裂原激活的蛋白激酶2（MAPK2）和轉錄因子Ca2+/cAMP應答元件結合蛋白（CREB），通過MAPK級聯反應使黑素細胞由G1期進入S期， 促進黑素細胞增殖。bFGF不僅是黑素細胞的促分裂劑，還是酪氨酸酶受體和蛋白激酶C（PKC）的激活劑，通過形成bFGF→激活酪氨酸激酶→激活酪氨酸酶→黑素生成這一級聯反應，刺激黑素細胞色素的生成及樹突生長。

②肝細胞生長因子（HGF）：HGF是一種多功能的生物因子，它能夠刺激多種上皮、內皮和間質細胞的生長、血管生成、免疫調節活性，促進細胞增殖、移動和侵襲[6]。HGF的受體C-MET具有酪氨酸激酶活性，通過C-MET激活MAPK途徑發揮多種功能。在黑素細胞培養基中加入HGF能夠促進黑素細胞的增殖和分化，而在其中加入抗HGF的抗體則能抑制成黑素細胞和黑素細胞的增殖[7]。實驗表明HGF能促進眼睛和皮膚的黑素細胞生長。

③粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）：GM-CSF由角質形成細胞分泌，與特定受體GMCSFR結合，通過激活信號轉導蛋白及轉錄活化劑（STAT-1、STAT-3和STAT-5）或促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），誘導黑素細胞增殖必需蛋白的增量調節[8]，參與調節黑素細胞的增殖與分化。Hirobe 等[9]將小鼠黑素細胞置于加入GM-CSF的培養基中培養，GM-CSF誘導了黑素細胞的增殖和分化，在其中加入抗GM-CSF的抗體則抑制黑素細胞的增殖和分化，而對照組無反應。

④內皮素（ET）：內皮素（ET）是體內天然存在的生理性因子，其家族成員包括ET-1、ET-2、ET-3。ET可以通過酪氨酸酶、酪氨酸酶相關蛋白-l（TRP-1）、MAPK、PKC、PKA等信號通路促進人黑素細胞（MC）的增殖和黑素合成，其中ET-1效果最顯著。ET-1具有促黑素細胞增殖、黑素生成、樹突形成、細胞粘附、移行以及防止紫外線照射引起的MC凋亡等多種作用[10]。小眼相關基因轉錄因子（Mitf）能夠啟動酪氨酸酶基因，是黑素細胞增殖和黑素合成的關鍵轉錄因子。ET-1可通過結合內皮素-B受體使絲裂原激動蛋白激酶（ERK1/2）磷酸化，激活Mitf，促進培養黑素細胞樹突數量增加，延長樹突長度，并呈劑量依賴性[11]。Szabad等[12]認為bFGF、內皮素-1、α–MSH三者合用可以替代TPA和牛垂體浸膏（BPE）在體外培養黑素細胞的增殖作用。

⑤干細胞因子（SCF）：皮膚中的SCF主要來源于成纖維細胞、角質形成細胞和血管內皮細胞。SCF與黑素細胞表面的受體（KIT）結合，當KIT受體被激活后，上調Mitf的磷酸化作用，激活TYR基因，使皮膚中的黑素前體細胞首先分化成Mitf+細胞和TRP-2+細胞,然后這些細胞再轉變成成熟的TRP-1+細胞[13]。SCF/KIT途徑在維持黑素細胞的存活、誘導遷移、促進增殖與分化中起了極為關鍵的作用。最新發現ET-1和SCF在cAMP和bFGF的協同作用下可以調節人類黑素細胞的生命周期，促進黑素細胞的增殖和分化[14]。

1.3.2 促黑素形成作用

α-黑素細胞刺激素（α-MSH）：α-MSH是一種內源性神經肽，來源于其前體激素阿黑皮素原（POMC）。α-MSH和黑皮素受體-1（MC-1R）結合,活化腺苷酸環化酶，提高細胞內環磷酸腺苷（cAMP）濃度，從而增強酪氨酸酶（TYR）的合成及表達,促進黑素合成。α-MSH還可促進黑素細胞（MC）樹突形成，但機制尚不清楚，可能受MC1R介導的胞內多種信號途徑的調控。在含α-MSH的培養條件下，體外培養的MC形成樹突的數目增加，形態亦更接近于體內狀態。

ET-1是一種纖維原細胞增長因子。ET-l在黑素生成過程中的作用與SCF/c-kit系統有關[15]。ET-1和α-MSH相互協同,通過增加酪氨酸酶的活性、提高酪氨酸酶相關蛋白1, 2的水平來刺激黑素的合成。

bFGF不僅是黑素細胞的促分裂劑,還是酪氨酸酶受體和蛋白激酶C（PKC）的激活劑,刺激黑素細胞色素的生成及樹突生長。

1.4 其他添加劑

血清能提供細胞增殖所必需的營養物質和生長因子，由于血清成分不明,胎牛血清可能包含異體蛋白而導致變態反應。Czajkowski等[17]運用無血清培養基（melanocyte growth medium，M2）培養黑素細胞,成功建立了原代培養，但有一半的患者無法獲得移植所需的足夠的細胞株。無TPA/CT和胎牛血清（FCS）的培養基雖然能獲得用于臨床移植的安全細胞株，但同時減少了黑素細胞的增殖率，這大大延長了培養時間，有時甚至導致培養失敗。

2 紫外線對體外培養黑素細胞的作用

紫外線是一種外源性的促細胞分裂劑。表皮存在一個復雜的旁分泌和自分泌網絡調節著人類黑素細胞的生存、增殖和功能，這個網絡通過紫外線作用而上調。受紫外線上調的因子包括α-MSH、ET-1、GM-CSF、SCF、bFGF、一氧化氮（NO）和組織胺等因子。中波紫外線UVB能夠刺激黑素細胞的增殖、移行及黑素合成。UVB誘導黑素生成是通過一氧化氮/環磷酸鳥苷/蛋白激酶G（NO/cGMP/PKG）途徑介導的。Larsson等[16]研究表明UVB誘導產生的黑素細胞DNA損傷片段可以激活酪氨酸酶的活性，從而促進黑素合成。Mulekar[18]在培養黑素細胞時加照紫外線，培養出的黑素細胞較未照紫外線的黑素細胞明顯活躍，表現為雙極、三極或多極樹突狀，數量明顯增加，細胞輪廓較明顯，移植活性更強。UVB還可以促進角質形成細胞釋放促黑素細胞增殖分化的因子如內皮素-1、IL-1a、成纖維細胞生長因子等。且UVB具有免疫抑制作用，可使移行及增殖的黑素細胞免受破壞。

3 黑素細胞與角質形成細胞或成纖維細胞共培養

角質形成細胞（KC）可分泌多種細胞因子，包括α–MSH、bFGF、神經生長因子（NGF）、內皮素（ET）、白介素- 1（IL-1）、GM-CSF及干細胞因子等，通過受體介導的信號通路調節黑素細胞的增殖和分化。KC對MC的生物學性狀也非常重要，MC可在移植部位形成色素沉著，而KC促進傷口快速愈合而不留瘢痕, 可獲得色素恢復和皮損愈合的雙重功效。因此角質形成細胞-黑素細胞共培養移植被眾多學者采用。當共培養中的KC密度過高時，可引起MC數目下調、活力下降。Eves等[19]建立了一種適合KC和MC共培養系統-化學成分處理的基質(丙烯酸、丙烯胺或這兩種單體的混合物與血漿聚合產生)和M2無血清培養基相結合，可以解決上述問題。

成纖維細胞產生的有絲分裂原可影響黑素細胞的生物學特征。Imokawa等發現培養4天的成纖維細胞介質可顯著刺激黑素細胞DNA的合成，且取自老化皮膚的纖維細胞的這種作用高于年輕皮膚的成纖維細胞。進一步研究發現兩者的介質中前者的HGF、干細胞因子高于后者，且加入抗HGF或抗SCF后，MC DNA合成下降32%，說明成纖維細胞分泌的HGF和SCF可刺激MC的DNA合成。

4 人毛囊無色素性黑素細胞（AMMC）培養

黑素細胞起源于神經嵴，在胚胎發育2～5 周開始向表皮和毛囊移行[20]。研究表明毛囊無色素性黑素細胞（AMMC）可以作為皮膚黑素細胞的儲庫，給白癜風的治療提供黑素細胞來源。由于AMMC在毛囊中的含量少，體外生長增殖緩慢，易被角質形成細胞和成纖維細胞污染，但可通過添加一些特殊的促生長因子純化培養AMMC。這些因子包括：①多肽類生長因子：如表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、SCF；②提高細胞內環磷酸腺苷水平的因子，如霍亂毒素；③蛋白激酶激動劑，如IBMX，TPA等[21]。培養中采用差別胰酶法去除角質形成細胞的污染[22]，采用100μg/ml的geneticin 處理去除成纖維細胞污染[21]。

5 永生化黑素細胞培養

通過轉染外源性基因，能夠調控和影響細胞的生長周期和增殖，獲得正常黑素細胞來源的永生化細胞株，為臨床研究提供細胞來源。常用的外源性基因有SV40T抗原、HPV的E6/E7、端粒酶逆轉錄酶等等，均成功構建了永生化的細胞系。由于誘導細胞的永生化多是外源性的原癌基因，存在潛在致癌性和病毒感染的可能，一定程度上限制了在臨床中的應用。Eaton等[23]提出利用Cre/loxP位點特異性重組酶系統聯合SV40TAg基因，使細胞既能無限增殖又無潛在的致癌性，可安全用于臨床。

6 結語

建立新型、安全、高效、經濟的黑素細胞體外培養方法，為黑素細胞基礎研究及臨床黑素細胞移植治療白癜風提供理想的細胞來源，特別是后者臨床療效具有廣闊的應用前景。

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Conditions of human melanocytes in vitro culture

ZHOU Mei-hua，LU Yan
Department of Dermatology and Venereology, the First Affliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China

This article summarys safe and effective cultured conditions of human melanocytes in vitro from the basic culture medium, additives, UV and co-culture system. Besides, it sum up the cultured conditions of the hair follicle amelanotic melanocytes and immortalized melanocytes. It is of great significance to the basis research and clinical treatment of the pigment diseases.

Melanocyte；Cultured conditions

R329.499.1

A

1674-1293(2011)01-0030-04

周梅華

2010-09-07

2011-01-20）

（本文編輯 祝賀）

江蘇省社會發展計劃項目（BS2007072）

210029，南京醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科（周梅華，魯嚴）

周梅華，女，碩士研究生，研究方向：皮膚色素性疾病，E-mail: zmhsmm@163.com.cn

魯嚴，E-mail: luyan1971@yahoo.com.cn