結(jié)合珠蛋白在阿薩希毛孢子菌小鼠皮膚感染中的表達與調(diào)控

敖俊紅，郝震鋒，祝 賀，樊 昕，王文嶺，夏志寬，楊蓉婭

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結(jié)合珠蛋白在阿薩希毛孢子菌小鼠皮膚感染中的表達與調(diào)控

敖俊紅，郝震鋒，祝 賀，樊 昕，王文嶺，夏志寬，楊蓉婭

目的 探討結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，Hp）在阿薩希毛孢子菌皮膚感染過程中的免疫調(diào)節(jié)作用。方法 80只BALB/c小鼠分為免疫抑制組和非免疫抑制組，兩組小鼠皮下均接種3.2× 107cfu/ml的阿薩希毛孢子菌菌懸液，分別于接種后0.5d、1d、3d、5d處死小鼠，取皮損組織，提取總RNA，RT-PCR檢測Hp mRNA表達，基因芯片技術(shù)研究免疫相關(guān)基因差異表達。結(jié)果 兩組小鼠在第0.5d、1d、3d、5d后皮損組織均擴增出Hp mRNA，其中免疫抑制組皮損組織 Hp mRNA表達水平明顯高于非免疫抑制對照組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。免疫抑制組感染1d后皮損組織 Hp mRNA表達明顯高于0.5d、3d、5d，組間比較均有顯著性差異（P＜0.01）。篩選出的11條免疫相關(guān)差異表達基因中編碼結(jié)合珠蛋白基因表達上調(diào)。結(jié)論 結(jié)合珠蛋白參與了皮膚阿薩希毛孢子菌感染的過程。

阿薩希毛孢子菌；結(jié)合珠蛋白；皮膚；感染

[J Pract Dermatol, 2011, 4(1):5-8]

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii, T. asahii)是引起毛孢子菌病的主要病原菌，我們在2000年報道了國內(nèi)首例播散性毛孢子菌病[1]。近年來，隨著細胞毒性化療、皮質(zhì)類固醇激素的廣泛應用、臟器移植的開展、惡性腫瘤的不斷上升，播散性毛孢子菌病的發(fā)病率也逐年上升[2]。結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，Hp）是一種活躍的急性期蛋白，具有結(jié)合血紅蛋白、抗感染、促進血管生成等作用。此外，結(jié)合珠蛋白還具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能[3]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合珠蛋白可抑制郎格漢斯細胞（langerhans cells，LC）免疫功能的成熟，可能通過影響LC的功能而參與免疫反應的調(diào)節(jié)[4,5]。本研究探討結(jié)合珠蛋白在阿薩希毛孢子菌皮膚感染中的作用，了解結(jié)合珠蛋白在感染局部的免疫功能。

1 材料和方法

1.1 材料

阿薩希毛孢子菌為筆者所在科室臨床分離菌株（AS2.2174）[1]，- 80℃保存。雄性BALB/c小鼠80只（軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心提供），體重20～28g。Trizol總RNA提取試劑盒和Access RT-PCR System試劑盒購自Promega公司；DEPC購自Sigma公司；Hp和β-actin引物由大連TaKaRa公司合成，Hp引物序列如下[6]：上游5′-ACCTTAAAC GAC GAG AAG CAATGG-3′,下游5′-AGC CAG ACA CGT AGC CCA CAC G-3′（482bp）。β-actin引物序列如下：上游5'-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3'，下游5'-CTC TTTGATGTCACGCACGATTTC-3'（540bp）。芯片雜交試劑盒和探針標記試劑盒購自上海聯(lián)合基因公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫抑制和菌懸液制備 80只小鼠隨機分為兩組，免疫抑制組和非免疫抑制組各40只。免疫抑制組小鼠接種前3天腹腔注射環(huán)磷酰胺（CTX）200mg/kg。T.asahii 在沙氏培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)2周，無菌生理鹽水沖洗培養(yǎng)基斜面，無菌紗布過濾，調(diào)整孢子懸液濃度為3.2×107cfu/ml。

1.2.2 接種和取材 每只小鼠背部兩側(cè)備皮，刮除直徑2.0cm區(qū)域內(nèi)皮毛，皮下接種0.2ml菌懸液。接種后分別于0.5d、1d、3d、5d，兩組分別隨機抽取10只小鼠處死，取接種處皮損組織，快速置于液氮預冷的無核酸酶凍存管中，迅速置液氮中保存。

1.2.3 總RNA提取 皮損組織標本在預置液氮的研缽中研碎后，移入離心管中，按Trizol一步法分別提取總RNA，-80℃保存。

1.2.4 RT-PCR 按Access RT-PCR System試劑盒說明進行。反應體積為50μl，包括dNTP 1μl，上游引物及下游引物各1μl，25mM MgSO42μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μl，Tf1聚合酶1μl，RNA模板1μl，5×PCR緩沖液 10μl，無核酸酶ddH2O 32μl。反應條件為48℃反轉(zhuǎn)錄45min；94℃變性30s，60℃退火1min，68℃延伸2min，30個循環(huán)；最后68℃延伸7min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，BioRad凝膠成像系統(tǒng)掃描，照像。應用Quantity One軟件對目的條帶進行密度掃描，以β-actin為內(nèi)參照，計算各組Hp與β-actin的相對灰度值，即目的基因的面積和密度的乘積與內(nèi)參照β-actin面積和密度的乘積之比，以此代表Hp mRNA的相對表達值。

1.2.5 基因芯片檢測

1.2.5.1 預雜交 芯片和雜交試劑I、II各6μl，分別在95℃雙蒸水中水浴2min，將雜交試劑滴加于芯片上，蓋上蓋玻片后42℃水平放置5h。

1.2.5.2 探針標記 取1.5ml EP 管，加入雙蒸水25μl、逆轉(zhuǎn)錄引物3μl；免疫抑制組和非免疫抑制組各取總RNA100μg，70℃條件下放置10min，取出后置于冰上。分別加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液10μl、DDT10μl、dNTP3μl；在暗室中加入逆轉(zhuǎn)錄酶2μl，免疫抑制組標本加熒光標記試劑Cy5-dCTP 3μl，非免疫抑制組標本加熒光標記試劑Cy3-dCTP 3μl，42℃反應2h；加入標記試劑I 4μl，65℃ 放置10min，加入標記試劑II 4μl混勻，避光，真空抽干至50μl；使用DNA純化柱純化DNA，加入標記試劑III 8μl，真空抽干。

1.2.5.3 雜交及洗片 將標記探針、雜交試劑和芯片分別于95℃水浴2min后混合，置于42℃雜交15～20h。洗片晾干備掃描。質(zhì)量控制：在芯片4096條基因中有87條管家基因，并以空白點樣液（3個點）、植物基因（8個點）作為陰性對照。非免疫抑制組、免疫抑制組掃描圖的平均信號強度與平均背景的比值均不低于3。

1.2.5.4 熒光掃描和數(shù)據(jù)分析采用Scan array 4000掃描儀掃描，用GenePix Pro3.0圖像處理軟件分析Cy3、Cy5熒光的強度，對原始數(shù)據(jù)進行均一化處理后分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSSl1.0軟件對免疫抑制組與非免疫抑制組Hp mRNA相對表達水平進行兩樣本均數(shù)t檢驗；對免疫抑制組與非免疫抑制組感染后0.5d、1d、3d、5d組間的Hp mRNA相對表達水平進行最小顯著差（LSD）t檢驗，顯著性檢驗水準為α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 提取總RNA PCR擴增結(jié)果

所有標本所得總RNA經(jīng)甲酰胺變性凝膠電泳分析可見清晰的28S和16S 兩條完整的條帶，28S的亮度大約是16S的2倍（圖1），測定A260/A280值介于1.8～2.0之間，表明RNA完整性及純度均較好，可以滿足下游實驗需要。

2.2 Hp mRNA表達水平及其與感染時間的關(guān)系

經(jīng)PCR擴增后，免疫抑制組和非免疫抑制組皮損均于482bp處擴增出一條有意義條帶（圖2）。用Quantity One軟件對凝膠上的目的條帶進行密度掃描，并求得Hp與β-actin的相對灰度值。免疫抑制組和非免疫抑制組Hp mRNA相對表達水平經(jīng)兩樣本均數(shù)t檢驗，差異具有統(tǒng)計學意義（t =8.97，P＜0.01），表明免疫抑制組Hp mRNA表達水平高于非免疫抑制組。對免疫抑制組不同感染時間Hp mRNA相對表達水平進行最小顯著差（LSD）t檢驗分析，感染1d后Hp mRNA相對表達水平明顯感染第0.5d、3d、5d，組間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而感染第0.5d、3d、5d 的Hp mRNA表達水平無明顯差異（P＞0.05），非免疫抑制組不同感染時間Hp mRNA相對表達水平無明顯差異（P＞0.05）（表1）。

表1 免疫抑制組與非免疫抑制組小鼠皮膚T. asahi感染后Hp mRNA相對灰度值

2.3 基因芯片

免疫抑制組和非免疫抑制組80個標本均篩選出11條免疫相關(guān)差異表達基因，與非免疫抑制組比較，免疫抑制組皮損標本中編碼結(jié)合珠蛋白基因表達上調(diào)，編碼補體C2基因、TNF誘導蛋白基因、干擾素誘導蛋白基因、CD53、CD22、CD209a抗原及CD79A結(jié)合蛋白1b基因、淋巴細胞抗原116及淋巴細胞抗原6復合物基因、前列腺素E受體4基因等表達下調(diào)（圖3）。

圖1 總RNA甲酰胺變性凝膠電泳

圖2 免疫抑制組和非免疫抑制組Hp mRNA表達電泳結(jié)果

圖3 基因芯片掃描圖

3 討論

毛孢子菌病（Trichosprosis）是由毛孢子菌感染引起的一種局部或系統(tǒng)播散性真菌病。國內(nèi)外有關(guān)皮膚、毛發(fā)、指甲等局部感染及系統(tǒng)性感染的報道不斷增多，毛孢子菌感染已成為除念珠菌外致人類播散性感染的第二大酵母菌感染[7]。T.asahii是播散性毛孢子菌病的主要致病菌，國外報道的毛孢子菌病，尤其是播散性毛孢子菌病，多發(fā)生于血液病、腫瘤、艾滋病等患者[8]，而健康人很少發(fā)病，說明宿主免疫功能狀態(tài)在致病真菌感染中起重要作用，而宿主感染T.asahii后免疫系統(tǒng)不能及時清除入侵的致病真菌的原因目前尚不清楚。

結(jié)合珠蛋白又稱觸珠蛋白，是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，作為一種急性期蛋白，在參與宿主抗感染、損傷組織的修復以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程中起著重要作用，其血清含量在感染、創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤、心肌梗死等病理狀態(tài)時顯著升高。結(jié)合珠蛋白主要在肝臟合成，但D'Anniento等[6]對小鼠的皮膚研究發(fā)現(xiàn)，正常小鼠皮膚組織中也有Hp mRNA表達，且經(jīng)LPS刺激后表達增強。Xie等[4]發(fā)現(xiàn)表皮朗格漢斯細胞（LC）胞漿中有結(jié)合珠蛋白，且可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)狀態(tài)下朗格漢斯細胞的功能轉(zhuǎn)化。本實驗采用RT-PCR和基因芯片技術(shù)對阿薩希毛孢子菌皮膚感染局部后Hp mRNA及Hp 基因表達進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫抑制組和非免疫抑制組小鼠皮下接種阿薩希毛孢子菌后皮損組織均擴增出Hp mRNA，免疫抑制組皮損組織 Hp mRNA表達水平明顯高于非免疫抑制組。基因芯片技術(shù)共篩選出11條免疫相關(guān)差異表達基因，其中編碼結(jié)合珠蛋白基因表達上調(diào)，說明Hp參與了皮膚感染T.asahii過程中宿主的免疫應答。T.asahii感染所致局部炎癥反應，可誘導局部皮膚結(jié)合珠蛋白的產(chǎn)生，具有一定的抗炎活性，以防止機體因過度炎癥反應所造成的損傷，這種抗炎作用由結(jié)合珠蛋白基因的表達水平和持續(xù)時間所決定[9]。本實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)免疫抑制組小鼠感染1天后皮損組織 Hp mRNA表達水平明顯高于0.5天、3天、5天，隨著感染時間延長，Hp mRNA表達水平逐漸降低。免疫抑制組局部Hp mRNA和編碼結(jié)合珠蛋白的基因表達上調(diào)，宿主炎癥反應將在一定程度上被削弱，這可能為真菌存活、建群、播散創(chuàng)造了一定的有利條件。另有研究表明結(jié)合珠蛋白有著多種免疫調(diào)節(jié)作用，其中一部分作用是通過其與CD11b結(jié)合來介導實現(xiàn)的，Arredouani 等[10]研究了結(jié)合珠蛋白對于輔助性T 細胞生成細胞因子的影響，體外試驗結(jié)果表明結(jié)合珠蛋白對Th2細胞因子（IL-4， IL-5，IL-10 and IL-13）的產(chǎn)生具有劑量依賴性抑制作用，而對于Th1細胞因子（IL-2 and IFN-gamma）等的釋放無明顯的作用，故認為結(jié)合珠蛋白具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中Th1/Th2平衡的作用，免疫抑制組感染局部Hp mRNA和編碼Hp基因表達上調(diào)，將抑制Th2細胞因子的生成，可能會一定程度上削弱機體針對T.asahii的體液免疫，一方面可以防止過度急性炎癥反應的產(chǎn)生，而另一方面也可能為阿薩希毛孢子菌的存活、感染發(fā)生及播散提供了有利的條件。

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Expression and regulation of haptoglobin in cutaneous Trichosporon asahii infection in mice

AO Jun-hong，HAO Zhen-feng，ZHU He，et al
Department of Dermatology, PLA. The Military General Hospital of Beijing, Beijing 100700, China

Objective To investigate the expression of haptoglobin (Hp) in the lesions and to explore its role in the regulation in cutaneous Trichosporon asahii infection. Methods Eighty BALB/c mice were divided into the immunosuppresive and nonimmunosuppressed group and injected with 3.2×107cfu/ml Trichosporon asahii on the skin. The cutaneous specimens were obtained on the 0.5, 1, 3, 5 days after inoculation. Total RNA of local cutaneous tissue were isolated. The expression of haptoglobin and the genes related to immunity after cutaneous infection of Trichosporon asahii were investigated by RT-PCR and gene expression chips. Results The Hp products from all of the skin specimens of inoculated sites were amplified with RT-PCR on 0.5, 1, 3, 5 days after inoculated. The expression of Hp mRNA in the immunosuppressive group was higher than that of in the nonimmunosuppressed group. There was a significant difference in the positive expression of HpmRNA between the immunosuppressive group and the nonimmunosuppressed group (P＜0.05). The expression of Hp mRNA on 1d after inoculated in the immunosuppressive group was higher than that of on 0.5, 3, 5 days after inoculated (P＜0.01). Eleven genes were screened out and the gene encoding Hp was up-regulated. Conclusion The results suggested that Hp take part in the course of Trichosporon asahii infection.

Trichosporon asahi；Haptoglobin；Skin；Infection

R756.6

A

1674-1293(2011)01-0005-04

敖俊紅

2010-09-11

2010-12-25)

（本文編輯 祝賀）

國家自然科學基金資助課題(30771939)

100070，北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚病診治中心（敖俊紅，郝震鋒，祝賀，樊昕，王文嶺，夏志寬，楊蓉婭）

敖俊紅，女，副主任醫(yī)師，研究方向：真菌感染臨床和實驗研究，E-mail: aojunhong@sina.com

楊蓉婭，E-mail: yangrya@sina.com