晚期糖基化終末產物及受體在實驗性2型糖尿病大鼠種植體周圍的變化及表達

穆 鄭 李 琳 朱正宏 劉海鑫 李 婷

南京同仁醫院口腔科，江蘇 南京 211100

糖尿病是一種遺傳、免疫功能紊亂、微生物感染等常見的內分泌系統代謝紊亂綜合征[1]。隨著經濟的發展、食物種類的變化、現代人的生活方式，糖尿病的發病率日趨增加，有資料表明[2]，遺傳、肥胖、年齡與2型糖尿病的發病有著密切的聯系。其中有一半的2型糖尿患者多在55歲以后發病，在這些患者中有不少的患者會有各種不同的牙齒問題，在其他一些修復方法不適合的情況下，牙種植技術成為他們最好的選擇。但已有研究證實[2]，骨組織中AGEs和RAGE相互作用是糖尿病骨質疏松的重要致病機制之一，因此糖尿病患者往往同時伴有骨質疏松癥。而骨整合是口腔種植的生物學基礎，種植體-骨界面的骨整合情況受多種因素的影響，但最主要的基礎因素是界面骨的骨結合率，鈣化成熟度，它們決定著界面的結合強度與種植體的最終穩定性。但據王瑞良等[3]研究結果顯示，即使在血糖得到良好的控制時，糖尿病患者的牙種植成功率仍然比較低。亦有動物實驗研究結果顯示，建立DM模型動物后，種植體植入體觀察一段時間后發現，種植體的骨整合率有顯著的下降[4]。然而DM對種植體骨整合的影響是比較復雜的過程，需進一步研究。因此本研究是在建立大鼠2型DM模型的基礎上，比較正常組與DM大鼠脛骨植入種植體后血清中AGEs的變化及種植體周圍骨組織中RAGE的表達變化，探討骨組織中AGEs和RAGE相互作用是使2型糖尿病影響種植體骨結合的機制之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與材料 鏈脲佐菌素（streptozotocin STZ，上海艾研生物科技有限公司），檸檬酸溶液，4%戊巴比妥鈉（南京同仁醫院麻醉科提供）。種植機及純鈦種植體，1.3 mm×7 mm（江蘇生物有限公司）。

1.1.2 動物 3月齡SD健康雄性大鼠45只，體重160～220 g（購于江蘇省疾病研究所）。

1.1.3 實驗儀器 ACCU-CHEK血糖儀（德國羅氏公司）；島津熒光分光光度計（RF-5301PC型）；抗RAGE單克隆抗體（上海研生生化試劑有限公司）；JJQ-P2016A生物組織切片機（武漢俊杰生物科技公司）；奧林巴斯UIS2顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 2型DM大鼠模型的建立 所有的實驗大鼠均適應性喂養2周，禁食12 h，隨機分為DM模型組25只（防止中途死亡和建模失敗）和正常對照組20只，先喂以高脂高果糖飼料4周，飲水為自來水，4周后小劑量鏈脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）腹腔注射1次，2周后誘導建立2型糖尿病模型，尾靜脈采血檢測血糖值，血糖高于11.1 mmol/L視為建模成功[3]，不符合者剔除。正常組則注射等量枸櫞酸鈉溶液。DM模型組中22只血糖達到預期標準，剩余3只未達到上述標準被淘汰。在飼養過程中因血糖過高，模型組大鼠死亡2只。將剩余20只建模成功的大鼠隨機分為DM組和DM種植組，每組10只。將20只正常組大鼠隨機分為正常對照組和正常種植組，每組10只。

1.2.2 植入種植體 手術區按常規手術備皮消毒，腹腔注射4%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）麻醉種植組大鼠，麻醉后于術區切開、剝離、露出骨面后定位，在生理鹽水冷卻下制備種植體窩，植入種植體，檢驗初期穩定性，創口對位縫合，術后給予青霉素粉劑預防感染。待實驗大鼠蘇醒后繼續給予常規喂養，并檢測DM組大鼠血糖，必要時按注射計量再注射1次，使其維持在實驗模型范圍內。

1.2.3 采集樣品 10周后測量血糖，再次稱體重，然后在禁食12 h后下腔靜脈采血后處死大鼠。種植組大鼠，于術區取下種植體，切取種植體及周圍骨組織；非種植組大鼠，切取左側脛骨近骺端約1 cm范圍內骨組織，剔除包括骨膜在內的所有軟組織，所取標本于10%中性緩沖福爾馬林液固定，EDTA脫鈣，乙醇中按順序逐級脫水，種植組平行于種植體連續石蠟切片，取種植體周圍4 mm的骨組織進行4μm切片行HE染色。

1.2.4 指標檢測及方法 用RF-5301PC型熒光分光光度計測定血清中AGEs的含量。骨組織RAGE表達變化，按上海研生生化試劑有限公司提供的RAGE免疫組化染色試劑盒說明書操作，所做標本在顯微鏡下觀察結果。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 種植體的愈合

種植組創口愈合良好，無感染，軟組織無紅腫、破潰。糖尿病種植組種植體部分二維方向上有0.5 cm的松動，其余種植體穩定性良好，無移位。

2.2 種植術后10周各組大鼠血清中血糖、AGEs和體重的變化

DM組和DM種植組血清中AGEs含量明顯增加，與其他兩組比價差異有統計學意義（P＜0.05）。四組間血糖及體重的變化，差異亦有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 血清中AGEs、血糖、體重的變化（）

表1 血清中AGEs、血糖、體重的變化（）

組別 n AGEs（AUPmg 蛋白） 血糖（mmol/L） 體重（g）正常對照組 10 0.0274000±0.0031283 6.12±2.43 512.00±36.74 DM組 10 0.2010000±0.0008723 22.26±3.18 245.00±42.54正常種植組 10 0.0378000±0.0019083 6.78±3.74 478.70±52.49 DM種植組 100.2121000 ±0.0004283 24.21±2..64 217.00±36.68 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 各組大鼠種植體周圍骨組織中RAGE結果分析

RAGE蛋白表達定位于骨細胞中。DM種植組（圖1-A）大鼠種植體周圍骨組織RAGE蛋白表達呈棕黃色至深棕色，分布較廣泛。DM組（圖1-B）亦出現RAGE蛋白的陽性表達，但其染色比較淡、呈淡棕色、分布散在。正常種植組（圖1-C）雖然RAGE也有零散的分布，但是其陽性表達率較DM種植組和正常種植組低，染色隱約顯示呈淡棕色，正常對照組（圖1-D）的骨組織RAGE蛋白陽性表達是四組中最低的。

圖1 4組大鼠脛骨在400倍光鏡下RAGE免疫組化表達

2.4 RAGE陽性細胞率的結果分析

DM種植組RAGE細胞陽性率是四組中最高，與其他各組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；DM組與其他各組比較亦較高，但低于DM種植組，差異有統計學意義（P＜0.05）；正常種植組和正常對照組比較，差值較小，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 種植術后10周骨組織RAGE陽性細胞率的比較（）

表2 種植術后10周骨組織RAGE陽性細胞率的比較（）

組別 n 百分比 F P正常對照組 10 0.25±0.65＜0.05正常種植組 10 0.33±0.55 13.245 DM 10 1.237±0.15 DM種植組 10 1.66±0.67

3 討論

近年來隨著口腔種植學不斷的發展完善，口腔種植修復是否成功的3個基本內容[5-6]，從患者來講主要考慮對美學，功能方面。從醫生角度來講主要考慮種植體與骨結合的長期穩定性。然而，由于DM患者的一系列病理變化，一方面，患者的抵抗力隨著血糖的升高及一些并發癥的發生而下降，影響了傷口的愈合；另一方面，DM患者同時存在骨代謝及磷、鈣代謝的紊亂，繼而會引發骨質疏松，從而使種植體的穩定性及其功能受到影響，因此較高的失敗率和較差的初期骨結合使糖尿病患者的種植修復成功率有所下降。

AGEs的形成又被稱為非酶促糖基化反應[8]，是指體內可還原酶（葡萄糖）與蛋白質氨基酸的游離氨基端的親核添加聚合過程，亦可稱之為添加反應。它主要有兩個階段，一個是可逆階段，一個是不可逆階段。不可逆階段經過復雜的重組后最終形成不可逆的AGEs[9]。Reddy等[10]證實AGEs可與其受體結合，誘導人間充質干細胞凋亡并阻止同源分化脂肪、軟骨、骨。AGEs也可通過促進單核/巨噬細胞產生白細胞介素（IL）-1、腫瘤壞死因子β等細胞因子，提高破骨細胞活性，加速骨吸收，從而參與了骨質疏松的發病。糖基化終末產物受體（RAGE）是目前已經確定的與AGEs結合的主要受體是[10]。AGEs通過與其受體RAGE結合蛋白相互作用，干擾骨重建過程，導致糖尿病骨代謝紊亂的發生發展。許多研究顯示RAGE參與了糖尿病骨質疏松的發生與發展過程。Santana等[11]研究表明，AGEs與RAGE相互作用是主要的致病途徑之一。有研究表明在糖尿病動物的顱蓋骨組織中RAGE的表達上調，應用RAGE的配體可以導致骨形成抑制，并且證明劑量與抑制作用成正比[12]。而本實驗研究結果顯示，DM組和DM種植組血清中AGEs的含量與其他組比較明顯升高，相對應免疫組化結果亦顯示RAGE的表達成陽性，AGEs和RAGE的相互作用使種植體的愈合沒有達到完全穩定性，因此在實驗結果檢測種植體愈合情況時發現有部分糖尿病組種植體愈合在二維上有0.5 cm范圍的松動，進一步說明DM組種植體沒有達到骨整合。

AGEs還可以增加骨的吸收[13]。單核巨噬細胞細胞膜上存在著AGEs受體，而AGEs修飾的蛋白對其具有趨化作用。AGEs在受體介導下與單核巨噬細胞結合，會釋放多種細胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1等[11-12]。這些細胞因子不僅增加其骨吸收活性，而且通過一些途徑促進破骨細胞前體細胞轉化為成熟的破骨細胞[13]。因此，AGEs的升高不僅使骨形成作用相對降低，而且使骨吸收也相對增加，從而導致骨量的丟失。而種植體的愈合基礎要達到骨整合，就需要一定的骨量支持，而骨量的丟失會影響到種植體的初期穩定性，從而影響其最終的使用功能。本研究發現糖尿病大鼠血清中AGEs明顯升高，但是在做標本切片時發現其骨密度則有所降低，因而推測，糖尿病狀態下的的大鼠其AGEs升高可能是導致種植體愈合不良的原因之一。

總之，糖尿病特別是2型糖尿病對種植體骨愈合的影響已被廣泛的接受，其影響因素也做了多方面的推測，但其機制目前有多種說法，沒有達成共識。本實驗也只是通過建立糖尿病大鼠模型，檢測血清中AGEs含量的變化和從免疫組化的方法分析RAGE的表達來探討其機制，結果檢測到2型DM大鼠血清中AGEs明顯升高，種植體愈合差，沒有達到骨整合。并且從免疫組化的結果來看，2型DM大鼠種植體周圍骨組織RAGE蛋白表達呈棕染色，明顯高于對照組。以此筆者推測，種植體骨組織中AGEs和RAGE相互作用是影響2型DM種植體骨結合的機制之一。

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