香蒲擬發網菌12S rDNA的PCR擴增及序列分析1)

張旭 潘景芝 劉福杰 王琦 李玉

(食藥用菌教育部工程研究中心(吉林農業大學)，長春，130118)(長春市傳染病醫院)(食藥用菌教育部工程研究中心(吉林農業大學))

黏菌(Myxomycetes)在生物界中是介于原生動物與真菌之間的一個特殊類群，其名稱、類群范圍及分類地位，在學者們中的見解始終不一致。雖然現代生物分類學的發展日益趨于多界系統，但黏菌仍然是一個存在爭議的類群［1］。黏菌的分布是世界性的，其生境最常見于林中陰涼濕潤的地方。黏菌在原生質團時期生活在潮濕的木頭縫隙和樹皮里面，爬行攝食，形成子實體時移到較干燥的基物表面，如腐朽木段、枯枝落葉、樹皮草莖。本研究在其它黏菌分子生物學研究的基礎上［2－7］，將現代分子生物學方法引入香蒲擬發網菌的系統分類，采用CTAB法對基物培養［8－12］獲得的研究標本進行DNA提取，用White等［13］設計的引物對其rDNA片段進行擴增和序列測定分析。探討了香蒲擬發網菌的分子系統學關系，為其系統演化研究提供理論依據。

1 材料與方法

香蒲擬發網菌的基物培養:將所采基物放于鋪滿濾紙的搪瓷盤中，用無菌水充分濕潤浸透，加塑料布遮蓋，給予一定散射光，在室溫(15～25℃)下培養，觀察黏菌原生質團和子實體的發育過程，至子實體成熟時，收集，陰干后放于標本盒中保存，鏡檢鑒定。

總DNA的提取:①CTAB DNA提取液的配制。CTAB 20 g/L，Tris－HCl(pH值8.0)50 mmol/L，Na2EDTA 10 mmol/L，NaCl 0.7 mmol/L。②TE緩沖液的配制。10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA(pH值8.0)。③破壁。取少量孢子(0.1 mg)置于1.5 mL離心管中，加入100 μL CTAB提取液，用玻璃研磨杵研磨。④消化。向離心管中再加入300 μL CTAB提取液，輕輕搖動。將管置于65℃水浴中消化1.0～1.5 h，在此過程中輕輕搖動2～3次。⑤抽提:加入等體積預冷的氯仿—異戊醇(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，劇烈振蕩使之形成懸乳狀。12 000 r/min離心10 min，將上清液移至一干凈的離心管中，重復2次。⑥沉淀。加入3 mol/L NaAc(100～130 μL)使溶液終濃度為0.1 mol/L。加入2倍體積預冷的無水乙醇，上下轉動混勻，放入－20℃冰箱過夜，沉淀DNA。⑦洗滌。12 000 r/min離心15 min，棄去上清液，用預冷的75%乙醇洗滌DNA沉淀，然后棄去冷乙醇。共洗滌2次。管中乙醇倒凈后，將管口傾斜倒置在濾紙上，使乙醇完全揮發。⑧溶解。加入30 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀，－20℃保存備用。

PCR擴增:PCR擴增引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成，12S上游引物(5'－AAG GAG CCG GTA TCA AGT A－3')，12S下游引物(5'－TAG AGG GAT GTG AAG TGC C－3')［13］。擴增反應體系為10倍PCR Buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl25.0 μL，dNTP 5.0 μL，引物各2.0 μL，Taq酶0.6 μL，模板4～6 μL，最后以ddH2O水補足至總體積50 μL。PCR反應條件為94℃變性50 s;48～55℃退火50 s，72℃延伸1 min，共循環35次，最后再72℃延伸10 min。在上述PCR的反應條件下，將DNA模板原液用TE緩沖液按1∶5，1∶10，1∶15梯度稀釋，改變引物濃度及各項反應條件，從而獲取最佳的DNA擴增條件。

PCR擴增產物的檢測:取PCR反應產物2.5 μL，在經溴化乙錠染色的1%的瓊脂糖凝膠上電泳25 min(200 V)后取出，在FR－200紫外與可見電泳分析裝置上觀察，并照相。

PCR產物的序列測定:將PCR原液送至北京三博遠志生物技術有限責任公司進行序列測定。

序列比對和系統發育樹的構建:采用Clustal X 1.83對NCBI上已注冊的黏菌12S rDNA基因序列片段進行比對，經BioEdit version7.0.9.0人工調整后，運用分析軟件MEGA4中基于缺失位點百分數的臨位相連法構建系統發育樹，同時進行2000次Bootstrap自舉法檢驗。

2 結果與分析

2.1 香蒲擬發網菌子實體及其孢絲、孢子形態

孢囊群生，有柄，窄圓柱形，頂端稍窄或鈍圓，直立，少數彎曲，全高3～5 mm，寬0.5～2.0 mm。囊被凋落。柄黑褐色，長為全高的1/3～1/2，囊軸黑色，向上漸細。孢絲稠密，彎曲，分枝并聯結。基質層膜質，褐色。孢子成堆時淺紫褐色，球形，有小疣，直徑7～9 μm。根據《中國真菌志——黏菌卷二》［14］鑒定為香蒲擬發網菌(圖1)。

圖1 香蒲擬發網菌及其孢絲、孢子

2.2 DNA提取

通過CTAB法得到高質量的黏菌DNA溶液，可以用于下一步試驗。DNA電泳結果見圖2。

2.3 PCR擴增

PCR反應適宜條件:所用DNA模板濃度以1∶5稀釋擴增效果最好。最佳的反應體系為10倍PCR Buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl25.0 μL，dNTP 5.0 μL，引物各2.0 μL，Taq酶0.6 μL，模板4 μL，最后以ddH2O補足至50 μL。

最佳反應溫度與時間:94℃變性50 s，在退火溫度為48℃、時間50 s時出現清晰的擴增條帶(圖3)，然后72℃延伸1 min，共35個循環，最后72℃再延伸10 min。

圖3 香蒲擬發網菌PCR擴增結果

圖2 香蒲擬發網菌DNA電泳結果

2.4 測序結果

香蒲擬發網菌12S rDNA片斷序列見圖4。該序列全長376 bp，GenBank登錄號為HM102318。

圖4 香蒲擬發網菌12S rDNA片斷序列

2.5 序列比對和系統發育樹的構建

香蒲擬發網菌與NCBI上查到的9個黏菌的12S rDNA序列片斷比對結果見圖5。

粉瘤屬的大粉瘤菌和筒菌屬的筒菌聚在一起，但筒菌的分化早于大粉瘤菌。粉瘤屬的大粉瘤菌，絨泡菌屬的圈絨泡菌、鈣皮菌屬的黑柄鈣皮菌和半網菌屬的棒形半網菌聚集在一起，其Bootstrap支持率為100%，顯示出十分密切的親緣關系。團網菌屬的灰團網菌與雙皮菌屬的輻射雙皮菌聚在一個分支上。擬發網菌屬的香蒲擬發網菌與煤絨菌屬的煤絨菌及半網菌屬蛇形半網菌聚在一個分支上，其支持率分別為66%和46%。

圖5 基于12S rDNA序列分析得到的NCBI已注冊黏菌的系統發育樹

3 結論與討論

基物培養是黏菌研究的一種必備手段，通過它可以豐富所考察地區的黏菌分布，彌補野外采集工作的不足。本試驗所采用的濕室培養方法簡便，無需對器皿和試劑進行消毒滅菌，使得以后的培養工作易于進行。從培養條件上看，變溫條件下濕室培養產生黏菌的頻率較高，溫度恒定或過于極端則不利于黏菌子實體的產生，可能是由于變溫的條件更接近于采集地自然的溫度，有利于黏菌子實體的形成。培養中對光照無苛求，只要保證水份濕度，讓其在自然的變溫和散射光條件下就可生長。

在提取黏菌DNA過程中，最重要因素即為細胞壁破壁過程，適當增加研磨時間可以提高提取DNA的質量。相對于玻片壓碎法［3］及勻漿器研磨法［15］，應用玻璃研磨杵在離心管中直接研磨黏菌孢子［16］，既可以避免勻漿器研磨后轉入離心管過程中標本的損失，又可以彌補玻片壓碎法中玻片僅能對黏菌孢子破壁的不足，從而可以更好地利用有限的標本資源，提取高質量黏菌DNA。

線粒體DNA是生物體內的核外遺傳信息載體，系共價閉環的環狀分子，分子量小，基因組中一般沒有間隔序列，結構簡單，為嚴格的母系遺傳，幾乎不發生倒位、易位等畸變與重組，使之容易被檢測。因而線粒體DNA越來越廣泛地被應用于各類群的系統進化研究。而12S rDNA基因是線粒體DNA上2個rRNA基因之一，在結構上存在4個結構域，第三結構域是相當保守的。該結構域包括32至48號莖，高度保守的側翼序列使它成為12S rDNA基因中最常被擴增的區域。同時，12S rDNA基因進化速度較16S、18S、28S rDNA快。因此12S rDNA基因序列適用于研究生物類群的種屬間系統發生關系［17］。

目前，GenBank中關于黏菌12S序列的報道僅有10個種，且關于香蒲擬發網菌分子生物學方面的研究尚未見報道。本研究首次成功地對香蒲擬發網菌的12S rDNA片段進行了PCR擴增。該序列的測得為進一步研究黏菌的系統演化提供了依據。由于部分黏菌的地域性及其培養條件的不成熟在一定程度上限制了黏菌標本的來源，進而限制了其分子生物學方面的發展，雖然基物培養在一定程度上解決了這個問題，但其培養條件及基物的選擇還有待進一步研究。

與傳統的形態學分類不同，在對已知的10個黏菌12S rDNA的序列比對中可以看出團網菌屬、半網菌屬、粉瘤屬、筒菌屬、絨泡菌屬、鈣皮菌屬和雙皮菌屬黏菌的關系較近，在演化的過程中交替出現。擬發網菌屬與煤絨菌屬、半網菌屬聚在一個分支上，但是其Bootstrap支持率不高，只能作為參考。黏菌系統發育的研究需要大量的黏菌基因序列對其分類進行支持，為以后的研究提出了思路。選用不同的分子標記也會造成截然不同的結論，這種現象在分子系統學研究中并不少見，可能是因不同的DNA標記在進化的各階段所起作用不同，或是統計分析方法中存在的某種缺陷所致，仍有待于作進一步研究。在研究某一特定類群的詳細系統親緣關系時，單憑某一種或某幾種方法是不夠的，必須綜合多方面資料(形態、生理、生化、古生物等)進行全面的考查與分析。DNA序列比對結果做為研究中的證據之一，還須結合形態學等多種手段，相互印證，才可得出符合客觀規律的結論，從而為物種的系統發育、生態學等研究提供重要的信息。

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