小葉黃楊葉斑病菌YC06生物學特性與殺菌劑篩選1)

邵陽 劉秋 胡英暢 閆建芳 齊小輝

(大連民族學院，大連，116600)

小葉黃楊(Buxus microphylla)是城市綠化的重要樹種之一［1］，原產我國西南、華中及福建、浙江、江蘇各省，現在各地都有栽培。隨著綠化環境中應用面積的逐步擴大，小葉黃楊的感病率也在逐年增加。某些地區小葉黃楊大面積枯死，已嚴重限制其在各種環境綠化中的應用。大連民族學院生命科學學院微生物工程課題組從小葉黃楊上分離到一種葉斑病病原菌，該菌引起小葉黃楊早期葉片脫落，繼而造成小葉黃楊莖斑成叢而死亡，嚴重危害小葉黃楊的生長。尤其在中國東北地區，該病害普遍流行。葉斑病是甜瓜重要病害之一，全國各地都有發生，也可引起黃瓜、冬瓜、絲瓜、苦瓜等蔬菜的病害，并已引起人們的重視，但目前對小葉黃楊葉斑病類病害的研究非常少。筆者研究小葉黃楊葉斑病致病菌生物學特性及不同藥劑藥效，明確小葉黃楊葉斑病菌的生物學特性以及生產上常用藥劑的抑菌效果，以期為生產上該病害的防治提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試病菌標樣的采集、分離及鑒定

小葉黃楊葉斑病病葉采自大連市開發區和沈陽市東陵區，采用葉片組織常規分離方法，PDA培養基培養，獲得病菌的純培養后，接種經冷凍處理的小葉黃楊健康植株，經致病性驗證后保存于大連民族學院微生物工程研究室。同時對小葉黃楊葉斑病病原菌進行形態觀察及ITS序列分析，ITS序列擴增引物為:ITS1，5'－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3');ITS4，5'－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3')［2］。培養基為PDA培養基、Czapek’s培養基［3］。

1.2 病菌生物學特性測定

不同碳源、氮源對病原菌菌絲生長的影響:采用不用碳源，即葡萄糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉依次等量替換Czapek’s培養基中的蔗糖進行碳源試驗;不同氮源即硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、天門冬酰胺依次等量替換培養基中的硝酸鉀進行氮源試驗。將直徑為3 mm的病原菌菌餅分別轉接到含不同碳源、氮源的平板培養基上，每一處理重復3次，在25℃恒溫條件下培養，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑［4］。

不同碳源對病原菌孢子萌發的影響:以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露聚糖為碳源分別配制0.1%和0.2%的糖溶液，在25℃恒溫條件下培養20 h，以清水作對照，統計孢子萌發率，每一處理重復3次。

pH值對病原菌菌絲生長的影響:滅菌后的PDA培養基在無菌條件下，用0.1 mol/L的鹽酸和0.1 mol/L的氫氧化鈉調節pH值，分別將培養基設計為3、4、5、6、6.5、7、8、9、10、11共10個pH值梯度。將病菌轉接到PDA培養基上，每個處理3次重復，在20℃恒溫條件下培養，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

光照對病原菌的影響:設置連續光照、連續黑暗、黑暗和光照各12 h交替3個處理。病原菌轉接到PDA平板培養基上，在上述條件下25℃恒溫培養，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3 殺菌劑抑菌效果測定

以PDA培養基為基礎培養基分別加入不同質量濃度的50%福美雙、50%撲海因、70%代森錳鋅、70%甲基托布津、50%速克靈、50%農利靈、50%特富靈、20%斷灰、50%翠貝、40%福星、72%克露共11種殺菌劑化學農藥，將病原菌轉接到相應的含藥培養基上，在25℃下恒溫培養5 d測量菌落直徑，并計算EC50［5］。菌絲生長抑制率=［(對照菌落直徑－處理菌落生長直徑)/對照菌落直徑］×100%。以殺菌劑質量濃度的自然對數為X軸，以抑制機率為Y軸，做散點圖，求得直線回歸方程，計算出EC50。

2 結果與分析

2.1 小葉黃楊葉斑病菌病原鑒定

Phoma和Phyllosticta2屬間的分類一直存在許多爭議。自Phoma和Phyllosticta2屬建立以來，主要依據Saccardo的分類標準進行分屬，2屬的分生孢子器和分生孢子的形態、色澤、大小均極相似［6］。Van der Aa等［7］報道，Phyllosticta屬的分生孢子產生尾狀非細胞附屬物，同時，根據該附屬物的長短、分生孢子及分生孢子器形態對Phyllosticta屬下種進行分類。本研究分離的小葉黃楊葉斑病病原菌生長緩慢，20 d菌落直徑為50 mm，形成圓形或近圓形菌落，墨綠色至深橄欖色。分生孢子器球形或亞球形，埋生或半埋生，直徑175～220 μm，高120～150 μm，壁厚15～20 μm，單生，褐色至黑褐色，有孔口，偶爾略突起呈喙狀(圖1)。產孢細胞卵圓形、燒瓶狀或短圓柱形，無色單細胞。分生孢子橢圓形或卵圓形，無色，大小(10.0～12.5)μm×(7.5～10.0)μm，平均值為11.5 μm×7.88 μm，分生孢子長寬比為1.41，具一根不分支、纖弱的黏液狀附屬物，長12.5～45.0 μm(圖2)。對小葉黃楊葉斑病病原菌的ITS序列分析表明，該病原菌為Phyllosticta spinarum(圖3)。GeneBank登錄號為EU275150。

圖1 小葉黃楊葉斑病病原菌分生孢子器的形態

圖2 小葉黃楊葉斑病病原菌分生孢子的形態

2.2 不同碳源、氮源對病菌生長的影響

在含有葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露聚糖5種不同碳源的培養基中，小葉黃楊葉斑病菌菌落直徑分別為66.3、68.9、59.1、56.2、54.3 mm。其中乳糖生長最為緩慢，氣生菌絲稀疏。在含葡萄糖、麥芽糖、蔗糖的培養基中氣生菌絲均為白色，基生菌絲為乳白色，其中麥芽糖生長最好，擴展速度較快。在含有硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、天門冬酰胺5種氮源的培養基中，有機氮源天門冬酰胺生長最好，菌落直徑為58.9 mm，菌絲茂盛，呈白色。硝酸鉀的生長情況次之，菌落直徑為55.1 mm。病原菌利用氯化銨最差，菌落直徑只有14.3 mm，氣生菌絲擴展較慢并且只在菌片上生長。天門冬酰胺的基生菌絲茂盛，中心呈褐色。硝酸鉀次之，基絲呈乳黃色。

圖3 菌株YC06 rDNAITS序列分析聚類結果

2.3 不同碳源對病原菌孢子萌發的影響

以清水為對照的5種碳源對病原菌孢子萌發影響的試驗結果表明，0.2%蔗糖溶液為病原菌孢子萌發的最佳碳源，0.2%麥芽糖溶液次之，而在清水中，孢子幾乎不萌發。

2.4 pH值對病原菌生長的影響

不同pH值對病原菌生長的影響試驗結果表明，該菌在pH值3～11時均生長良好，差別不明顯。說明該菌適宜生長的pH值范圍廣泛。其中在pH=5.5的條件下，生長略好。菌落的氣生菌絲、基絲生長茂盛，基絲均為墨綠色，產生分生孢子器。

2.5 光照對病原菌的影響

在連續光照、連續黑暗、黑暗和光照各12 h交替3種條件下菌落直徑分別為74.8、56.5、69.7 mm，說明該菌種在光照條件下生長能力強于其它條件。

2.6 殺菌劑對病原菌生長的影響

比較11種殺菌劑的EC50，25%斷灰對病原菌的抑制效果最好，其EC50為0.000 30 μg。50%特富靈次之，其EC50為0.00056 μg。50%翠貝和72%克露對病原菌的抑制效果最差(表3)。

表3 殺菌劑對病原菌的抑菌效果

3 結論與討論

小葉黃楊葉斑病菌菌絲生長的最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為天門冬酰胺。在20～25℃下、各種pH值條件下以及光照條件下菌絲生長良好。在25℃下小葉黃楊葉斑病原菌在0.2%蔗糖溶液中孢子發芽率最高。通過對11種農藥的EC50的比較，20%斷灰對病原菌抑制效果最好，50%特富靈次之。斷灰農藥通用名稱為嘧霉胺，屬于苯胺基嘧啶類殺菌劑，為當前防治灰霉病活性較好的殺菌劑。其作用機理是通過抑制病菌浸染酶的產生從而阻止病菌的侵染并殺死病菌。特富靈為三氟咔唑類殺菌劑，其作用機理為麥角甾醇生物合成抑制劑。最初用于麥類、果樹、蔬菜等白粉病、銹病的防治。二者均為新型低毒性殺菌劑，可作為防治小葉黃楊葉斑病的首選藥物。在8類殺菌劑中，取代脲類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對該病原菌的抑菌效果均不明顯。而在2種有機硫殺菌劑中，雖然福美雙的抑菌效果較好，但由于其毒性，福美雙已被聯合國環境規劃署、聯合國糧食及農業組織限制使用，因此，建議不采用福美雙進行該病害的防治。二甲酰亞胺類殺菌劑的速克靈和撲海因，以及有機硅殺菌劑福星可作為防治該病害的使用的備選農藥。

葉點霉屬(Phyllosticta)是球殼孢目中的重要屬，其中很多種是引起植物葉、莖和根部病害的重要病原菌，能引起葉斑、莖枯、根腐、果腐或穎枯等癥狀，常造成植物早期落葉和腐爛［7］。目前國內外關于葉點霉屬對小葉黃楊危害的研究較少，但近年來由該病原菌引起小葉黃楊葉斑、莖枯乃至成叢死亡的現象越來越嚴重。筆者在致病性測定過程中，發現凍傷更易接種成功，這和東北寒冷地區，小葉黃楊葉斑病發病嚴重的現象相吻合，即小葉黃楊受到凍傷，將加劇該病害的發生。目前，隨著人們綠化意識逐步增強，小葉黃楊的利用將更加廣泛，所以及早開展小葉黃楊葉斑病的防治是有必要的，筆者的研究結果將為生產上該病害的防治提供一定的理論基礎。

［1］杜鳳國，于曉光，呂偉偉，等.小葉黃楊抗寒性的初步研究［J］.北方園藝，2011(2):98－100.

［2］刑曉科，郭順星.從ITS序列探討豬苓與其伴生菌的親緣關系［J］.微生物學通報，2004，31(2):34－36.

［3］方中達.植病研究法［M］.3版.北京:中國農業出版社，1998:46－50.

［4］王樹和，許曉利，郭巖，等.4種殺菌劑對八仙花葉點霉菌的毒力測定［J］.河南農業科學，2006(9):91－92.

［5］慕立義.植物化學保護研究方法［M］.北京:中國農業出版社，1994:79－81.

［6］于莉，鮑文杰，張英，等.Phoma和Phyllosticta兩屬分類的研究進展［J］.吉林農業大學學報，1995，17(4):102－107.

［7］Van der Aa H A，Vanev S.A revision of the species described in Phyllosticta［M］.Utrecht:Centraalbureau voor Schimmelcultures，2002.