黑加侖花色苷的提取及抗氧化活性研究

賈　娜，孔保華*，張洪濤

(東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

黑加侖花色苷的提取及抗氧化活性研究

賈娜，孔保華*，張洪濤

(東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

采用溶劑提取法對黑加侖花色苷進行提取，通過測定花色苷提取量、2,2-二苯基-1-間三硝基苯基聯肼(DPPH)自由基清除率、還原能力綜合確定最佳提取條件，以獲得具有較高提取量和較高抗氧化活性的黑加侖花色苷提取液，并將提取液與丁羥基茴香醚(BHA)和抗壞血酸的抗氧化能力進行比較。結果表明：黑加侖花色苷最佳提取工藝為提取溶劑乙醇鹽酸溶液，其中乙醇體積分數40%、鹽酸質量分數0.5%、提取料液比1∶10(g/mL)、提取時間2h，所得提取液的花色苷質量濃度為86.15mg/L，即凍果中提取量為172.29mg/100g，此時提取液的DPPH自由基清除率為71.64%，還原能力為1.64(以A700表示)；花色苷質量濃度0.1mg/mL的提取液較同質量濃度的BHA和抗壞血酸具有更高的還原能力和自由基清除能力(P＜0.05)。因此，黑加侖富含具有較強抗氧化能力的花色苷，具有良好的開發應用前景。

黑加侖；花色苷；提取；抗氧化能力

食品中的合成抗氧化劑對人體具有潛在的危害[1]，因此，開發天然抗氧化劑尤為重要。花色苷作為植物的主要呈色物質不但具有較強的自由基清除能力和抗氧化能力，還具有潛在的營養價值和醫療價值[2]。紫黑色小漿果和葡萄中的花色苷含量豐富，黑加侖作為小漿果的一種，鮮果花色苷含量可達201mg/100g[3]，黑加侖果實及其制品呈現深紅色則是由于高含量的花色苷所致。水溶性花色苷主要存在于黑加侖的果皮中，總花色苷含量至少為2000mg/kg新鮮果皮[4]。早在1977年Koeppen等[5]就已經發現黑加侖含有豐富的花色苷。國外對于黑加侖花色苷的研究主要集中在黑加侖花色苷的提取[2,4]、花色苷單體的分離鑒定[6]和穩定性分析[7]。國內對黑加侖花色苷的提取、純化和鑒定有一定的研究[8-9]，但較少考慮提取條件對抗氧化能力的影響，大部分研究僅以花色苷含量作為衡量指標。本研究對不同提取條件下的花色苷提取量和抗氧化能力同時進行測定，確定黑加侖花色苷最佳提取條件，將花色苷與相同濃度的抗氧化劑丁羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)、抗壞血酸進行比較，探討其抗氧化效果。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黑加侖凍果，購自哈爾濱高泰食品公司，-18℃保存。

2,2-二苯基-1-間三硝基苯基聯肼(DPPH)、2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)、2-D-脫氧核糖 美國Sigma公司；丁羥基茴香醚、抗壞血酸、鄰苯三酚、Tris堿、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)等均為國產分析純。

1.2儀器與設備

UT-1800型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；DK-8B型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；AL-104型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司；pHS-25型pH計 上海精科雷磁儀器廠。

1.3方法

1.3.1黑加侖花色苷的提取

取黑加侖凍果適量，室溫解凍后，放入攪拌機中攪碎。稱取5g破碎后的黑加侖，在一定條件下用提取溶劑于35℃浸提，真空抽濾，所得濾液用于測定各項指標。

1.3.2單因素試驗

分別考察不同提取溶劑、乙醇體積分數、料液比、提取時間和鹽酸質量分數對花色苷提取量和提取液的還原能力、DPPH自由基清除能力的影響，通過單因素試驗確定最佳提取條件。

1.3.3花色苷提取量測定

采用pH示差法[10]。取適量提取液，分別用pH1.0的KCl-HCl緩沖液(0.025mol/L)和pH4.5的乙酸鈉-HCl緩沖液(0.4mol/L)稀釋至適當倍數(使pH1.0時的吸光度在0.2～0.7之間)，放置15min后，于波長520nm處測定吸光度，按下式計算凍果中的花色苷提取量：

式中：449.29是矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質量/ (g/mol)；DF是稀釋倍數；V是提取溶劑的體積/mL；26900是矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數/(L·mol/cm)；m是黑加侖的質量/g；1是比色皿的光路長度/cm。

1.3.4還原能力的測定

采用Oyaizu等[11]的方法。0.5mL待測液與2.5mL磷酸鹽緩沖液(pH6.6，0.2mol/L)和2.5mL 1%鐵氰化鉀混合，50℃保溫20min，快速冷卻后，加入10% TCA 2.5mL，3000r/min離心10min，取上清液5mL，加入5mL蒸餾水和1mL 0.1%氯化鐵溶液，混勻后放置10min，于700nm測定吸光度。用吸光度A700直接表示還原力，吸光度越大還原能力越強。

1.3.5DPPH自由基清除能力的測定

參照Yang等[12]的方法。0.1mL待測液與3.0mL 0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液混合，室溫避光反應30min，波長517nm處測定吸光度，按下式計算DPPH自由基清除率。

式中：Ac為對照的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.3.6超氧陰離子自由基清除能力的測定

參照Xiang等[13]的方法并稍加修改。0.1mL待測液與2.85mL Tris-鹽酸(pH8.2，50mmol/L)混合，25℃保溫10min后，加入0.1mL 25℃預熱的6mmol/L鄰苯三酚，迅速搖勻，于波長320nm處每隔30s測定吸光度，按照下式計算超氧陰離子自由基清除率。

式中：Ac為鄰苯三酚自氧化速率，即每分鐘增加的吸光度；As為加入樣品后，每分鐘增加的吸光度。

1.3.7羥自由基清除能力的測定

參照Lee等[14]的方法。0.1mL待測液與1mL反應緩沖液混合(含0.1mmol/L FeCl3，0.104mmol/L EDTA，1.5mmol/L H2O2，2.5mmol/L脫氧核糖，0.1mmol/L 抗壞血酸，pH7.4)，37℃水浴保溫1h后，加入1mL 2.8% TCA溶液和1mL 0.5% TBA(0.025mol/L NaOH溶液溶解)，80℃水浴保溫30min。冷卻后，于波長532nm處測定吸光度，按下式計算羥自由基清除率。

式中：Ac為對照的吸光度，As為樣品的吸光度。

1.3.8ABTS自由基清除能力的測定

參照Ozgen等[15]的方法并稍加改動。7.0mmol/L ABTS·與終濃度為2.45mmol/L的過硫酸鉀混合，室溫避光放置12～16h。用pH4.5的乙酸鈉溶液(20mmol/L)稀釋至波長734nm處的吸光度為0.7±0.02。取3mL該溶液與20μL待測液混合，放置6min，于波長734nm處測定吸光度，按照下式計算ABTS自由基清除率。

式中：Ac為對照的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.4數據分析

每個實驗重復3次，結果表示為“平均值±標準差”。數據統計分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性(P＜0.05)分析使用Tukey HSD程序。

2　結果與分析

2.1黑加侖花色苷提取條件的確定

2.1.1提取溶劑的確定

用不同溶劑以料液比1∶20在35℃提取2h所得的花色苷提取量、還原能力和DPPH自由基清除率見表1。可以看出，乙醇鹽酸溶液為提取溶劑時，花色苷提取量最高，為175.52mg/100g，還原能力和DPPH自由基清除能力最強，分別為1.38和74.56%，與其他提取溶劑相比，差異性顯著(P＜0.05)。因此，選擇乙醇鹽酸溶液為提取溶劑。

表1　提取溶劑對花色苷提取量和抗氧化能力的影響Table 1 Anthocyanin contents and antioxidant activity of different solvent extracts from blackcurrants

2.1.2乙醇體積分數的確定

圖1　乙醇體積分數對花色苷提取量和抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate and antioxidant activity of anthocyanins

由圖1可以看出，用乙醇鹽酸溶液(鹽酸質量分數1%)以料液比1∶20在35℃提取2h，乙醇體積分數從20%增加到40%時，提取量從165.64mg/100g顯著增加到177.27mg/100g(P＜0.05)，隨后隨著乙醇體積分數的增加，提取量增加緩慢，且不顯著(P＞0.05)，并且當乙醇體積分數80%時，花色苷提取量略有降低，這與Patil等[16]的研究結果相似。由于黑加侖中含有部分親水性花色苷，因此沒有選擇100%乙醇提取。DPPH自由基清除率和還原能力在乙醇體積分數為20%和80%時較低，乙醇體積分數為40%、50%、60%時較高，但相互之間差異不顯著(P＞0.05)。若乙醇體積分數較高，則提取物不適合作為食品著色劑[16]。綜合考慮，選擇40%乙醇進行提取較好。

2.1.3料液比的確定

以40%乙醇鹽酸溶液(鹽酸質量分數1%)為提取溶劑，用不同料液比于35℃提取2h所得的花色苷提取量、還原能力和DPPH自由基清除率見圖2，料液比為1∶5時，花色苷提取量最低，為154.14mg/100g，料液比為1∶10時，顯著增加到179.55mg/100g(P＜0.05)，料液比為1∶30時，提取量達到最高為189.83mg/100g。還原能力和DPPH自由基清除能力變化趨勢相似，料液比為1∶5時二者均最低，分別為0.87和56.50%，料液比減小到1∶10時，分別顯著增加到1.05和62.44%(P＜0.05)，隨后隨著料液比的減小，二者均增加不顯著(P＞0.05)。綜合以上情況，為了節省提取溶劑以及縮短濃縮時間，選擇料液比為1∶10進行提取。

圖2　料液比對花色苷提取量和抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on extraction rate and antioxidant activity of anthocyanins

2.1.4提取時間的確定

以40%乙醇鹽酸溶液(鹽酸質量分數1%)為提取溶劑，在料液比1∶10的條件下于35℃提取不同時間所得的花色苷提取量、還原能力和DPPH自由基清除率見圖3，可以看出，隨著提取時間的延長，花色苷提取量先增加后降低，2h時達到最高，為170.44mg/100g。提取時間延長，提取量降低，可能是由于花色苷本身不穩定，提取時間過長對花色苷造成破壞。DPPH自由基清除率也是在提取時間為2h時達到最高，為65.18%，但清除率整體趨勢變化緩慢。還原能力也隨著提取時間先增加后降低，在4h時達到最大值1.62，但是與2h相比，差異不顯著(P＜0.05)。由于4h時的花色苷提取量較低，因此選擇提取時間為2h。

圖3　提取時間對花色苷提取量和抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate and antioxidant activity of anthocyanins

2.1.5鹽酸質量分數的確定

分別以0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%的鹽酸與40%乙醇溶液混合作為提取溶劑，以料液比1∶10于35℃提取2h所得的花色苷提取量和抗氧化效果如圖4所示，鹽酸對花色苷提取量的影響差異性不顯著(P＞0.05)。DPPH自由基清除能力隨著鹽酸質量分數的增加而逐漸增加，鹽酸質量分數為0.1%時，清除率最低，為62.07%，與其他質量分數的清除率相比，差異性顯著(P＜0.05)；鹽酸質量分數0.5%時，清除率為71.64%，與1%和1.5%時的清除率相比，差異性不顯著(P＞0.05)；鹽酸質量分數2%時，清除率最高，為77.30%。還原能力隨著pH值的增加，先增加后降低，鹽酸質量分數1%時，還原能力最強，但與0.5%和1%時相比，差異不顯著(P＞0.05)。綜合考慮花色苷提取量、DPPH自由基清除率和還原能力，選擇鹽酸為0.5%進行提取，此時的花色苷提取量為172.29mg/100g，DPPH自由基清除率為71.64%，還原能力為1.64。

圖4　鹽酸質量分數對花色苷提取量和抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of HCl concentration on extraction rate and antioxidant activity of anthocyanins

2.2黑加侖花色苷的抗氧化性

花色苷含量為0.01%的提取液與質量分數0.01% BHA和抗壞血酸兩種抗氧化劑的抗氧化能力比較見表2，可以看出，提取物的還原能力、超氧陰離子自由基清除率、ABTS自由基清除率顯著高于抗壞血酸和BHA(P＜0.05)，而抗壞血酸和BHA二者之間差異不顯著(P＞0.05)；提取物的羥自由基清除率顯著高于抗壞血酸(P＜0.05)，但與BHA差異不顯著(P＜0.05)；提取物的DPPH自由基清除率顯著高于BHA和抗壞血酸(P＜0.05)，抗壞血酸的DPPH自由基清除率顯著高于BHA(P＜0.05)。由以上結果可以看出黑加侖花色苷提取物的抗氧化效果明顯高于BHA和抗壞血酸。

表2　黑加侖提取物與抗壞血酸、BHA抗氧化能力的比較Table 2 Comparison of antioxidant activities among blackcurrant anthocyanins, ascorbic acid and BHA

3　討論與結論

由于花色苷是極性分子，因此常用乙醇、甲醇或丙酮做為提取溶劑[17]。Bridgers等[18]以甲醇、酸化甲醇、乙醇和酸化乙醇提取紫紅薯中的花色苷時發現，酸化甲醇的提取效果最好。Awika等[19]用丙酮和酸化甲醇對黑高粱花色苷進行提取，發現酸化甲醇的提取效果優于丙酮，經過反相高效液相色譜分析，丙酮提取的花色苷分子的結構被修飾，因此丙酮不適合提取高粱屬的花色苷。盡管很多報道表明甲醇的提取效果最好，但是考慮到甲醇的毒性，選擇乙醇為提取溶劑。此外，花色苷在中性或堿性條件下不穩定，通常采用酸化的有機溶劑進行提取，而且已有研究證實了酸化有機溶劑的提取效果優于單獨使用有機溶劑的提取效果，本研究選擇檸檬酸、乙酸和鹽酸進行提取實驗。

在確定乙醇體積分數時，發現隨著乙醇體積分數的升高，花色苷提取量增加緩慢，乙醇為80%時，花色苷提取量略有降低，這與Patil等[16]的研究結果相似，Patil在提取紅蘿卜花色苷時，發現乙醇體積分數從20%增加到80%的過程中，花色苷提取量先增加，在50%達到最大值，隨后花色苷提取量降低。Vatai等[20]用50%、70%、100%丙酮提取葡萄殘渣中花色苷，發現丙酮濃度為50%時，花色苷提取量最高。這可能是由于有機溶劑濃度增加降低了親水性花色苷的提取率，從而導致了總花色苷提取量降低。

Revilla等[21]在提取紅葡萄花色苷時發現，使用質量分數高于1%的鹽酸進行提取時，非乙酰化花色苷和香豆酰化花色苷的含量增加，但會導致乙酰化花色苷糖基部分水解，含量降低，因此盡管總花色苷含量增加，但為了防止乙酰化花色苷水解，也應避免使用質量分數高于1%的鹽酸。這也是本實驗選擇0.5%鹽酸進行提取的原因。

Koponen等[3]用甲醇鹽酸提取黑加侖花色苷，鮮果花色苷提取量為201mg/100g，但并未對提取液的抗氧化能力進行測定。由于本實驗選用的是黑加侖凍果，因此略低于該提取量。

將0.01%的黑加侖花色苷與相同質量濃度的BHA、抗壞血酸進行比較，發現花色苷提取物具有較高的抗氧化能力，除了羥自由基清除能力略低于BHA以外，其他抗氧化指標均高于BHA和抗壞血酸，說明黑加侖花色苷是一種理想的抗氧化劑。

通過單因素試驗確定黑加侖花色苷最佳提取工藝為提取溶劑乙醇鹽酸溶液、其中乙醇體積分數40%、鹽酸質量分數0.5%、提取料液比1∶10(g/mL)、提取時間2h，所得提取液的花色苷質量濃度86.15mg/L，即提取量172.29mg/100g，此時提取液的DPPH自由基清除率為71.64%，還原能力為1.64；花色苷質量濃度0.1mg/mL的提取液較同質量濃度的BHA和抗壞血酸具有更高的還原能力和自由基清除能力(P＜0.05)。這些研究結果表明，黑加侖果實中花色苷含量豐富且具有較強的抗氧化能力，作為一種天然抗氧化劑，黑加侖花色苷具有良好的開發和應用前景。

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Extraction and Antioxidant Activity of Anthocyanins from Blackcurrants

JIA Na，KONG Bao-hua*，ZHANG Hong-tao
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In order to optimize the extraction of anthocyanins from blackcurrants, the effects of solvent type, ethanol concentration, material/liquid ratio, extraction time, HCl concentration on the extraction yield of anthocyanins and the DPPH free radical scavenging rate and reducing power of blackcurrant extracts were explored. Extraction for 2 h at a material/liquid ratio of 1∶10 (g/mL) using acidified aqueous ethanol (containing 40% ethanol and 0.5% HCl) as the extraction solvent provided optimum extraction of anthocyanins from blackcurrants. The resultant extraction yield of anthocyanins and the anthocyanin content, DPPH free radical scavenging rate and reducing power of the obtained blackcurrant extract were 172.29 mg/100 g of fruit, 86.15 mg/L, 71.64% and 1.64 (A700), respectively. Blackcurrant anthocyanins at the concentration of 0.1 mg/mL revealed stronger DPPH free radical scavenging rate and reducing power than BHA and ascorbic acid of the same concentration (P ＜ 0.05). Thus, blackcurrant, rich in highly antioxidant anthocyanins, has a promising prospect for development and application.

blackcurrant；anthocyanins；extraction；antioxidant activity

TS202.3

A

1002-6630(2011)16-0162-05

2010-11-12

國家公益性行業(農業)科研專項(200903012-02)

賈娜(1982—)，女，博士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：jiana_2010@163.com

*通信作者：孔保華(1963—)，女，教授，博士，研究方向為畜產品加工。E-mail：kongbh@163.com