超聲提取鼠尾草葉多糖工藝優(yōu)化及其DPPH自由基清除能力評價

祝元婷，吳文林，張 利*，劉 琪

(四川農業(yè)大學生命科學與理學院，四川 雅安 625014)

超聲提取鼠尾草葉多糖工藝優(yōu)化及其DPPH自由基清除能力評價

祝元婷，吳文林，張 利*，劉 琪

(四川農業(yè)大學生命科學與理學院，四川 雅安 625014)

以鼠尾草(Salvia officinalis L.)葉為材料，采用單因素試驗和正交試驗，探討超聲提取其多糖的最佳工藝條件，并利用1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除法評價該多糖的自由基清除能力。結果表明：超聲提取多糖的最佳工藝條件為：提取時間7min、提取2次、料液比1∶40，在此條件下鼠尾草葉多糖的提取率為3.27%。同時該多糖對DPPH自由基有較好的清除作用，當質量濃度為160μg/mL時，清除率達到82%，并且對DPPH自由基清除能力IC50為112μg/mL。

鼠尾草；多糖；超聲提取；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)

唇形科(Lamiaceae)鼠尾草屬植物鼠尾草(Salvia officinalis L.)，又名撒爾維亞、廚房鼠尾草、達爾馬希亞鼠尾草，為多年生草本植物，原產于歐洲地中海地區(qū)[1]。在國外，廣泛飲用“鼠尾草茶”，并常常將其作為廚房用的香草，用作防腐、烹飪的調味料等。

根據(jù)國外研究結果，鼠尾草具有防腐抗菌[2]、抗氧化[3]、抗突變[4]、保護腸胃[5]、消炎[6-7]和調節(jié)免疫[8]等作用，其多糖具有免疫[8-10]、抗氧化[11]等活性。我國從20世紀80年代開始在上海、北京等地引種鼠尾草，并對其精油抗菌活性[12]、葉提取物抗氧化作用[13]等進行一些研究，但尚未見國內關于鼠尾草多糖的研究。

目前，國外已有對鼠尾草葉多糖的研究，采用傳統(tǒng)的熱水浸提法提取[14]。近年來，超聲波、微波、酶等提取方法，已廣泛應用于多糖的提取[15]。本實驗采用超聲提取法對鼠尾草葉多糖的提取工藝進行研究，并評價其DPPH自由基清除能力，旨在為鼠尾草天然保健品的開發(fā)利用提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠尾草，由美國國家種質資源庫(national plant germplasm system，NPGS)提供，四川農業(yè)大學生命科學與理學院植物學教研室鑒定為唇形科植物鼠尾草(Salvia officinalis)；DPPH(分析純) 美國Sigma公司；甲醇、氯仿、乙醇和正丁醇(均為分析純) 成都科龍化工有限公司；實驗用水均為超純水(電阻率≥18 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設備

中藥粉碎機 天津泰格斯儀器有限公司；UV-3200PC紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；JP99-2D超聲波細胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化設備儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 浙江黃巖求精真空泵廠。

1.3 多糖的提取及含量測定

鼠尾草葉60℃烘干、粉碎，過60目篩；甲醇∶氯仿(10∶1，V/V)回流5h；揮干溶劑，繼續(xù)用80%乙醇回流5h，干燥粉碎備用；準確稱取0.5g(精確至0.1mg)材料粉末，加入超純水，使用超聲波粉碎儀提取，提取液定容至100mL，即得多糖提取液。苯酚-硫酸法[16]測定多糖含量，以葡萄糖為標準物，用UV-3200PC紫外可見分光光度計作比色分析。

1.4 影響多糖提取率的單因素和正交試驗

1.4.1 不同提取時間對多糖提取率的影響

采用料液比1∶50，提取次數(shù)3次，提取時間分別為1、2、3、4、5、6、7、8 m i n，以鼠尾草葉多糖提取率為評價指標，考察不同提取時間對鼠尾草葉多糖提取率的影響。

1.4.2 不同提取次數(shù)對多糖提取率的影響

采用料液比1∶50，提取時間5min，提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5、6次，以鼠尾草葉多糖提取率為評價指標，考察不同提取次數(shù)對鼠尾草葉多糖提取率的影響。

1.4.3 不同料液比對多糖提取率的影響

采用提取時間5min，提取次數(shù)3次，料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，以鼠尾草葉多糖提取率為評價指標，考察不同料液比對鼠尾草葉多糖提取率的影響。

1.4.4 鼠尾草葉多糖提取工藝正交試驗

在單因素試驗基礎上，以超聲提取時間、提取次數(shù)和料液比為3因素，各取3個水平，用L9(34)正交表進行試驗，以鼠尾草葉多糖提取率為評價指標，確定提取鼠尾草葉多糖的最佳提取工藝。

1.5 DPPH自由基清除活性

1.5.1 鼠尾草葉多糖的純化

稱取50g材料，按最佳工藝進行超聲提取。將提取液按Y a n g等[17]報道方法純化：將提取液濃縮至400mL，并加入95%(V/V)的乙醇水溶液，醇沉，于4℃放置12h。所得粗多糖沉淀用100mL水進行溶解，用Sevag法除蛋白，脫蛋白溶液用超純水透析48h，然后用4倍體積的95%乙醇溶液再沉淀。沉淀物分別采用無水乙醇和丙酮進行洗滌，然后干燥得多糖樣品，備用。

1.5.2 清除率測定

參考Capek等[11]方法測定DPPH自由基清除率，并以VC作為陽性對照。將多糖和VC溶于水中，并分別配制成6個梯度的多糖和VC溶液(10、20、40、80、160、320μg/mL)，分別取2mL上述溶液和2mL DPPH溶液(0.08mg/mL)于三角瓶中，混合搖勻，室溫下靜置30min，在517nm處以空白作對照測定吸光度。自由基清除能力按如下公式進行計算：

式中：ADPPH為未加入多糖樣品或VC的DPPH溶液的吸光度；A樣品為DPPH溶液加多糖樣品或VC后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 超聲提取鼠尾草葉多糖單因素試驗

2.1.1 超聲提取時間對多糖提取率的影響

圖1 超聲時間(A)、提取次數(shù)(B)和料液比(C)對多糖提取的影響Fig.1 Effects of ultrasonic treatment time, number of extractions and material-to-liquid ratio on polysaccharide yield

由圖1A可知，隨著提取時間的增加，多糖的提取率提高，在提取時間6min時，多糖提取率最高。當提取時間大于6min后，多糖提取率不再增加，反而有所降低。這可能是因為隨著時間的延長，由于超聲波的空化效應，固液擴散速度加快，有利于多糖的浸出；而當提取時間繼續(xù)延長時，多糖結構受到破壞，且溶劑蒸發(fā)較快，都將影響多糖的提取率。所以，選擇5、6、7min作為正交試驗的3個水平。

2.1.2 超聲提取次數(shù)對多糖提取率的影響

由圖1B可知，隨著提取次數(shù)的增加，多糖的提取率升高。當提取次數(shù)大于3后，提取率增幅趨于平緩。這是因為在所設定的超聲提取條件下，經3次提取，大部分多糖已經提取出，繼續(xù)增加提取次數(shù)，多糖提取率的增加不明顯。所以，選擇2、3、4次作為正交試驗的3個水平。

2.1.3 超聲提取料液比對多糖提取率的影響

由圖1C可知，在料液比為1∶30時多糖提取率達到最大，此后，隨著液料比的增加，多糖提取率迅速降低，其原因可能在于過大的溶劑體積，使超聲波在液體中的空化效應不均勻，底層的樣品粉末所受的空化效應偏低，導致多糖提取率降低。所以，選擇料液比1∶20、1∶30、1∶40作為正交試驗的3個水平。

2.2 鼠尾草葉多糖提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)提取時間、提取次數(shù)、料液比的單因素試驗結果選擇的3個水平，設計L9(34)正交試驗及結果見表1。

表1 鼠尾草葉多糖提取正交試驗設計及結果Table 1 Orthogonal array design and corresponding experimental results

表2 正交試驗結果方差分析Table 2 Analysis of variance for polysaccharide yield with various extraction conditions

由表1R值可知，影響多糖提取率的因素主次關系為C(料液比)＞B(提取次數(shù))＞A(提取時間)，即料液比對多糖提取率的影響最大。由表2方差分析可知，C(料液比)對鼠尾草葉多糖的超聲提取率具有極顯著影響，B (提取次數(shù))對多糖的提取率具有顯著影響，而A(提取時間)對超聲法提取鼠尾草多糖的提取率無顯著性影響。

綜上所述，最優(yōu)工藝組合條件為A3B1C3，即正交試驗中的第7組試驗，即鼠尾草葉多糖提取的最佳工藝條件為提取時間7min，提取次數(shù)2次，料液比1∶40，在此條件下多糖提取率為3.27%。

2.3 DPPH自由基清除活性

圖3 鼠尾草多糖的清除作用Fig.3 Comparison of DPPH free radical scavenging rates of VC and polysaccharides from Salvia officinalis L. leaves

由圖3可以看出，該多糖對DPPH自由基有較強的清除能力，當多糖質量濃度10μg/mL時，對DPPH自由基的清除率為54.04%，隨著多糖質量濃度的增加，對DPPH自由基的清除作用增加，當多糖質量濃度在10～160μg/mL時，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應，當多糖質量濃度為160μg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到82%。此后，繼續(xù)增大多糖的質量濃度，其清除率提高趨于平緩。同時，從分析可得，鼠尾草葉多糖對DPPH自由基清除能力IC50為112μg/mL。由此可見，該多糖的自由基清除作用相當顯著。

3 結 論

采用超聲提取鼠尾草葉多糖的最佳工藝條件為提取時間7min，提取次數(shù)2次，料液比1∶40，在此條件下鼠尾草葉多糖的提取率為3.27%。同時該多糖對DPPH自由基有較好的清除作用，IC50值為112μg/mL，并且當質量濃度為160μg/mL時，清除率達到82%。

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Optimization of Ultrasonic Extraction of Polysaccharides from Salvia officinalis L. Leaves and Their DPPH Free Radical Scavenging Activity

ZHU Yuan-ting，WU Wen-lin，ZHANG Li*，LIU Qi
(College of Biology and Science, Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014, China)

The conditions for ultrasonic extraction of polysaccharides from Salvia officinalis L. leaves were optimized by onefactor-at-a-time and orthogonal array design methods. A material-to-liquid ratio of 1∶40 for 7 min extractions performed twice proved optimal. The resultant polysaccharide yield was 3.27%. The polysaccharide extract obtained had excellent DPPH free radical scavenging effect, revealing a scavenging rate of 82% at the concentration of 160μ g/mL and an IC50 of 112μ g/mL.

Salvia officinalis；polysaccharide；ultrasonic extraction；1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)

TQ929.2

A

1002-6630(2011)16-0076-04

2010-11-22

四川省青年科技基金資助項目(08ZQ026-034)；四川省科技廳科技支撐計劃資助項目(2008FZ0148；2008SZ0074)

祝元婷(1990—)，女，學士，研究方向為植物化學。E-mail：zhuyuantingwode@163.com

*通信作者：張利(1969—)，女，教授，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：zhang8434@sina.com