紅酵母番茄紅素提取工藝優(yōu)化

王海兵，吳曉英*，劉世龍，徐瑩瑩

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006)

紅酵母番茄紅素提取工藝優(yōu)化

王海兵，吳曉英*，劉世龍，徐瑩瑩

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006)

從破壁方法、浸提溶劑及提取條件等方面對黏紅酵母番茄紅素提取工藝進行優(yōu)化研究。采用單因素試驗對破壁方法及浸提溶劑進行選擇，結(jié)果表明熱酸法是黏紅酵母破壁提取番茄紅素的最佳方法，丙酮-乙酸乙酯(1∶1)混合液是理想的提取溶劑。采用正交試驗方法對液料比、提取溫度和提取時間等番茄紅素提取條件進行優(yōu)化，得到適宜的提取條件為丙酮-乙酸乙酯(1∶1)溶劑添加量60mL/g、提取溫度30℃、提取時間3h。在此提取工藝下，得到紅酵母番茄紅素提取量為4.55mg/g，比未優(yōu)化時的3.22mg/g增加了41.30%。

紅酵母；番茄紅素；提取工藝

番茄紅素(lycopene)是一種具有11個共軛雙鍵的脂溶性不飽和碳氫化合物，是類胡蘿卜素的一種。在所有類胡蘿卜素中，番茄紅素具有最強的消除單線氧功能，其對單線氧的消除能力是β-胡蘿卜素的兩倍，抗氧化作用也明顯優(yōu)于β-胡蘿卜素，同時還具有清除自由基、誘導細胞分化、減少DNA損傷等作用[1-2]，在消除氧自由基、降低癌癥發(fā)病率、增強人體免疫功能以及防治心腦血管疾病方面具有良好的應(yīng)用前景[3]。

目前，番茄紅素基本來源于植物和微生物，提取方法主要有溶劑浸提法[4]和超臨界萃取法[5]。溶劑浸取法操作簡單，超臨界萃取法工藝復雜，技術(shù)和設(shè)備要求高。本實驗從一種能產(chǎn)番茄紅素的紅酵母菌體中提取番茄紅素，采用單因素試驗的方法研究合適的破壁方法和浸提溶劑，隨后采用正交試驗的方法，研究在不同的提取溫度、時間、液料比等條件下的提取效果，最終確定最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

黏紅酵母2.27為本實驗室篩選和保藏。

丙酮(分析純) 天津市富宇精細化工有限公司；鹽酸(分析純) 上海市中翔化學試劑有限公司；石英砂(生化試劑) 天津市大茂化學試劑廠；乙酸乙酯(分析純) 天津市博迪化工有限公司；石油醚(分析純)、過氧化氫(分析純)、雙氧水(含體積分數(shù)30%H2O2的水溶液) 廣州化學試劑廠；濃縮酵母浸出膏(生化試劑) 浙江省富陽市杭富生物制品廠；大豆蛋白胨(生化試劑) 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蝸牛酶(生化試劑) 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。

番茄紅素標準品 上海融和醫(yī)藥公司；煙堿(95%)西安天則生物技術(shù)有限責任公司；酮康唑 廣州迪越化工有限公司；青霉素 廣州美津生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸出粉10g/L、瓊脂20g/L、自然pH值；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸出粉10g/L、自然pH值；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50g/L、蛋白胨15g/L、酵母粉 10g/L、初始pH5、核黃素0.5mg/L、吐溫-80體積分數(shù)1.5%。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SHP-450D型生化培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；SKYB2112B型恒溫搖床 廣州科橋?qū)嶒灱夹g(shù)設(shè)備有限公司；LD5-2A型低速離心機 北京醫(yī)用離心機廠；2802S型紫外分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司；1525高效液相色譜儀、2487紫外分光檢測器 日本W(wǎng)aters公司。

1.2 方法

1.2.1 菌體發(fā)酵液制備

黏紅酵母2.27經(jīng)菌種活化培養(yǎng)，再進行種子培養(yǎng)，然后以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在光照條件下，28℃，200r/min振蕩培養(yǎng)，分別在發(fā)酵的24h加入煙堿2.5mL/L和青霉素4mg/L，36h時添加雙氧水1.2mL/L，60h時添加酮康唑400mg/L，96h后發(fā)酵結(jié)束[6]。發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心10min后，收集菌體，貯存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 紅酵母番茄紅素的提取方法

紅酵母細胞的破壁方法：由于番茄紅素為胞內(nèi)色素，必須破壁之后才能提高色素的提取率。紅酵母的細胞壁比較堅硬，用丙酮等有機溶劑對其破壞程度不高。實驗中選用酸熱水解法[7]、研磨法、酶消化法、酶超聲波破碎法4種便于實驗室操作的酵母破壁方法[8]，其具體操作和破壁效果如下：

熱酸破碎法：培養(yǎng)酵母，獲取發(fā)酵液10mL，裝于15mL離心管中，4000r/min離心10min，水洗后得酵母泥，然后加入3mol/L HCl溶液5mL浸泡1.5h，然后再分別沸水浴6min，迅速冷卻，4000r/min離心10min，得沉淀水洗2次，離心得到菌體殘片；分別加入丙酮9mL，混合均勻，浸提1h，4000r/min離心10min，得到色素丙酮浸提液。

研磨法：取發(fā)酵液10mL，裝于15mL離心管中離心，水洗后得酵母泥。將其轉(zhuǎn)入研缽中，加適量石英砂，充分研磨0.5h，然后再將其轉(zhuǎn)移到離心管中，離心，得菌體殘片，再加入丙酮9 m L，混合均勻，浸提1h，4000r/min離心10min，得到色素丙酮浸提液。

酶消化法：取10mL搖瓶發(fā)酵液，裝于15mL離心管中，4000r/min離心10min，得沉淀，水洗一次，再制成10mL菌懸液，按45mg/g酶量加入蝸牛消化酶，調(diào)節(jié)pH4.5，放至搖床，在37℃，分別處理6h，然后離心得菌體殘片，再加入丙酮9mL，混合均勻，浸提1h，4000r/min離心10min，得到色素丙酮浸提液。直接測量分光光度。

酶消化協(xié)同超聲破碎法：取10mL搖瓶發(fā)酵液，裝于15mL離心管中，4000r/min離心20min，得沉淀，水洗一次，再制成10mL菌懸液，按45mg/g酶量加入蝸牛消化酶，調(diào)節(jié)pH4.5，放至搖床，37℃處理6h。隨后在菌液中伸入超聲探頭，將超聲功率調(diào)至100%，頻率為開5s、關(guān)3s，處理15min，離心得菌體殘片，再加入丙酮9mL，混合均勻，浸提1h，4000r/min離心10min，得到色素丙酮浸提液。

1.2.3 不同溶劑提取比較

紅酵母細胞破壁后，用正己烷、乙酸乙酯、石油醚以及混合溶劑代替丙酮，比較提取效果。

1.2.4 提取條件的優(yōu)化

紅酵母細胞破壁后，對液料比、提取時間、提取溫度對色素提取的影響進行正交試驗，確定最優(yōu)組合，計算優(yōu)組合理論產(chǎn)量。

1.2.5 番茄紅素含量的測定

將色素提取液用0.22μm微孔濾膜過濾后，以高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定提取液中番茄紅素的含量。同時配制不同質(zhì)量濃度的標準品溶液，在相同條件下測定，根據(jù)峰面積制備標準曲線定量。

高效液相色譜條件：色譜柱為C18硅膠柱(250mm× 4.6mm，5μm)；Binary高效泵，檢測器為Waters-2487，Double λ Absorbance D etector；數(shù)據(jù)分析軟件：Breeze；流動相為乙腈-二氯甲烷＝10∶90(V/V)；檢測波長472nm；流速1.0mL/min；柱溫28℃；進樣量10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄紅素標準曲線

準確稱量2.5mg的番茄紅素標準品，用丙酮溶解，定容于10mL的棕色容量瓶中，質(zhì)量濃度250μg/mL。再分別稀釋成50、100、150、200、250μg/mL質(zhì)量濃度梯度，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后HPLC檢測，數(shù)據(jù)處理，得到番茄紅素標準曲線方程：y=10.892χ，R2=0.9984。

2.2 不同破壁方法對紅酵母番茄紅素提取效果的影響

由酸熱水解法、研磨法、酶消化法、酶超聲波破碎法4種破壁方法得到的色素初提液，用HPLC方法測定番茄紅素的提取量，結(jié)果見表1。

由表1可知，熱酸法和研磨法的破壁效果比較好，酶消化法和酶-超聲法效果較差，因此，本實驗選用熱酸法來進行細胞破壁。由于番茄紅素的長鏈共軛結(jié)構(gòu)，有很強的還原性[9]，長時間在加熱的酸性條件下會不太穩(wěn)定，會引起部分分解破壞，使得提取量和純度會有所降低，所以繼續(xù)探索更加溫和、效率更高的細胞破壁方法是值得進一步研究的方向，例如研磨法與酶法相耦合。

表1 不同破壁方法的破壁效果Table 1 Effect of cell wall disruption methods on extraction rate of lycopene

2.3 不同溶劑對紅酵母番茄紅素提取效果的影響

用熱酸破壁后，離心、水洗、離心后倒掉上清液，得菌體殘片，在分別加入乙酸乙酯、正己烷、石油醚、丙酮等以及不同比例混合的溶劑進行浸提試驗，其中石油醚和正己烷得到的浸提液基本無色，其余溶劑浸提得到的結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取溶劑對番茄紅素提取量的影響Fig.1 Effect of different organic solvents on extraction rate of lycopene

由圖1可知，乙酸乙酯和丙酮是比較適合紅酵母番茄紅素的提取溶劑，用不同比例的兩種溶劑混合進行提取試驗，發(fā)現(xiàn)番茄紅素提取量有一定程度的提高，當以乙酸乙酯-丙酮(1∶1)混合液作為溶劑提取時，番茄紅素提取量可達到最大值4.46mg/g，因此本實驗選用乙酸乙酯-丙酮(1∶1)混合液作為浸提溶劑。

2.4 紅酵母番茄紅素提取工藝的優(yōu)化

確定紅酵母番茄紅素提取的細胞破碎方法、浸提溶劑后，對提取時間、提取溫度、液料比3因素進行正交試驗優(yōu)化，其因素水平及設(shè)計與結(jié)果見表2、3。

由表2、3可知，各因素對番茄紅素提取量的影響不盡相同。從極差來看，提取條件對番茄紅素提取量的影響大小為液料比＞浸提時間＞浸提溫度。7號試驗的番茄紅素含量最大，所以7號所對應(yīng)的條件組合A3B1C3為最佳提取條件，即浸提時間3h、提取溫度30℃、液料比60∶1。在該條件下，番茄紅素提取量可達到4.55mg/g，比優(yōu)化前的提取量3.22mg/g提高了41.3%。

表2 紅酵母番茄紅素提取工藝正交試驗各因素及水平Table 2 Factors and levels in orthogonal array design

表3 紅酵母番茄紅素提取工藝正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果分析Table 3 Orthogonal array design and corresponding experimental results

3 結(jié)論與討論

本實驗從破壁方法、浸提溶劑及提取條件等方面對黏紅酵母番茄紅素的提取進行研究，結(jié)果表明：熱酸法破碎細胞壁最效率最高，用乙酸乙酯-丙酮(1∶1)的混合溶劑提取效果最好，在液料比60∶1(mL/g)、提取溫度30℃、浸提時間3h的條件下，番茄紅素提取量最大，可達到4.55mg/g。

本實驗是在實驗室條件下，對紅酵母內(nèi)番茄紅素的提取工藝進行探索，對于工業(yè)實際應(yīng)用還有一些需要改進的地方[10]。在細胞破碎方法上，雖然熱酸效率最高，但該法操作步驟較為復雜，用時相對較長，熱酸對番茄紅素有一定的破壞作用，因而工業(yè)上實際應(yīng)用時可考慮采用效率同樣不錯的研磨法或者高壓勻漿法，結(jié)合酶法[11-12]，可以減少番茄紅素的損失，使得提取效率進一步提高；所用浸提劑的選擇上，在具體的某些行業(yè)(比如食品行業(yè))對有毒的有機溶劑殘留要求較嚴格，這時可以采用提取效果稍低、但對人體無毒的乙酸乙酯作為浸提溶劑[13]；在提取條件上，增加溶劑與菌體的接觸以及進行多次萃取，可以增加最終的番茄紅素提取量[14-15]。

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Optimization of Extraction Process for Lycopene from Rhodotorula glutins

WANG Hai-bing，WU Xiao-ying*，LIU Shi-long，XU Ying-ying
(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

Cell wall disruption followed by organic solvent extraction was used to extract lycopene from Rhodotorula glutins. The optimal cell wall disruption method and extraction solvent were found to be hot acid treatment and acetone-ethyl acetate (1∶1), respectively. Three extraction conditions such as material-to-liquid ratio, temperature and time were optimized by orthogonal array design to be 1∶60 (g/mL), 30 ℃ and 3 h, respectively. Under these conditions, the extraction rate of lycopene was 4.55 mg/g, 41.30% higher than before optimization.

Rhodotorula；lycopene；extraction process

TS264.4

A

1002-6630(2011)16-0045-04

2010-10-15

華南理工大學國家大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目(091056154)

王海兵(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為生物制藥。E-mail：2004seaside@163.com

*通信作者：吳曉英(1961—)，女，副教授，碩士，研究方向為生物制藥和生物活性物質(zhì)。E-mail：xywu@scut.edu.cn