飼糧添加25-羥基維生素D3對輪狀病毒攻毒和未攻毒斷奶仔豬血清和腸內容物抗體和細胞因子水平的影響

廖 波 張克英＊ 丁雪梅 徐志文 白世平

腹瀉是斷奶仔豬生產中危害較大的疾病,嚴重危害仔豬生產。斷奶時期免疫功能低下、消化道發育不完善是仔豬對病原體抵抗差,易發生腸道疾病的重要原因[1-5]。因此,如何通過營養措施調節免疫反應來對抗疾病,從而實現提高仔豬生產的目的成為動物營養學研究的熱點。近30年的研究證實,維生素D3,主要是其激素活性形式1,25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2-D3],不僅在傳統鈣磷穩衡中發揮著重要作用,在調節動物機體的免疫反應中也起著重要作用[6]。1,25-(OH)2-D3能調節T細胞、B細胞和巨噬細胞的分化、成熟、分泌細胞因子和免疫球蛋白[7-10]。在畜禽上的研究顯示,1,25-(OH)2-D3對豬[11-12]和牛[13]的免疫功能有重要影響。25-OH-D 3是維生素D3在飼料生產中的最新應用形式,與普通的維生素D 3相比在吸收轉運方面有突出的優勢[14]。因此,在斷奶仔豬飼糧中添加25-OH-D3是否能更好地發揮維生素D3的免疫調節功能值得研究。本試驗擬在輪狀病毒感染斷奶仔豬的條件下,研究飼糧添加高水平的25-OH-D 3對斷奶仔豬血清和腸內容物抗體和細胞因子水平的影響,旨在為25-OH-D3在仔豬飼糧中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.25 %25-OH-D3(1 μg=40 IU,DSM)、其他單體維生素(Bayer)、MEM 液(Gibco)、胰蛋白酶抑制劑(Sigma)、亮抑蛋白酶肽(Sigma)。

1.2 試驗動物及飼糧

試驗動物選用48頭28日齡斷奶的平均體重為(7.35±0.75)kg的杜長大三元雜交仔豬。試驗飼糧參照美國NRC(1998)5～10 kg階段生長豬的營養需要配合成粉狀全價料,基礎飼糧組成及營養水平見表1。對照組飼糧添加 220 IU/kg(5.5μg/kg)的25-OH-D3,試驗組飼糧添加2 200 IU/kg(55.0μg/kg)的 25-OH-D3(為 NRC推薦量的10倍)。

1.3 試驗設計與飼養管理

試驗采用2×2雙因子設計,C-、C+組分別為未攻毒和攻毒對照組,T-、T+組分別為未攻毒和攻毒試驗組。所選仔豬按體重相近原則隨機分配到4個組中(每組12個重復,每個重復1頭豬),單籠飼養,未攻毒處理和攻毒處理各飼養在1間隔離環境控室內。試驗期21 d。舍內溫度保持在25～28℃。飼養管理按常規飼養管理進行,仔豬自由采食飲水。

1.4 病毒接種

攻毒試驗采用的病毒為人輪狀病毒(HRV)Wa株,由四川農業大學動物生物技術中心提供。在試驗第0天08：00,攻毒處理的每頭仔豬用注射器灌服輪狀病毒1 mL(輪狀病毒濃度為 1×106TCID 50/mL),未攻毒處理的每頭仔豬用同樣方式灌服同體積MEM液。

1.5 樣品采集與制備

在試驗第0、5、15、21 天的 08：00,每組分別隨機選取6、12、8、4頭仔豬,從前腔靜脈采血10 mL,3 000 r/min離心10 min取血清,-20℃保存。采血前1天20：00停喂飼糧,使仔豬空腹12 h。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

在試驗第5、15、21天分 3次進行屠宰,每次屠宰每組取4頭仔豬。在屠宰前,將各組的仔豬按體重相近原則分為3個小組,隨機選取1個小組的仔豬進行屠宰。屠宰前1天20：00停喂飼糧,使仔豬空腹12 h。屠宰試驗在08：00點開始,通過前腔靜脈注射過量戊巴比妥鈉(1 mL/kg BW,戊巴比妥鈉濃度為1 g/mL)致死仔豬。分別在十二指腸和回盲結節處末端結扎,收集回腸內容物(IC),用MEM液按IC：MEM 液為1∶2的比例稀釋IC,加入胰蛋白酶抑制劑 250μg/mL、亮抑蛋白酶肽50μg/mL,以防細胞因子等成分的降解[15],將IC-20℃保存。

1.6 測定指標與方法

血清和IC中的免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白 A(IgA)含量采用IgG&A&M試劑盒(Maker)測定,輪狀病毒抗體(RV-Ab)水平采用豬輪狀病毒抗體酶聯免疫吸附試劑盒(ADL)測定,細胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素 -6(IL-6)、干擾素-γ(IFN-γ)水平采用豬細胞因子酶聯免疫吸附試劑盒(ADL)測定。

1.7 數據處理與分析

結果以平均值±標準誤表示,數據采用SPSS 13.0軟件的GLM的Univariate法進行互作分析,然后進行Duncan氏多重比較,以 P＜0.01(極顯著),P＜0.05(顯著)作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 抗體

2.1.1 血清IgG、IgM 、IgA 含量

由表2可知,飼糧添加10倍 NRC推薦量的25-OH-D3顯著降低了試驗第5天仔豬血清IgG含量(P=0.005)和第5、15天血清IgM(P=0.035,P=0.003)和IgA含量(P=0.008,P=0.010)。輪狀病毒攻毒顯著增加了試驗第15天仔豬血清IgG含量(P=0.040)以及第 5、15天血清 IgM(P=0.000,P=0.000)和IgA含量(P=0.002,P=0.043)。25-OH-D3與輪狀病毒的交互作用對試驗期內各階段仔豬血清IgG含量均無顯著影響(P＞0.05),但對試驗第15天血清IgM(P=0.000)和IgA含量(P=0.038)有顯著影響。

表2 血清IgG、IgM和IgA含量Table 2 IgG,IgM and IgA contents in serum mg/m L

2.1.2 腸內容物IgG、IgM、IgA含量

由表3可知,飼糧添加10倍NRC推薦量的25-OH-D 3有提高仔豬腸內容物IgG、IgM、IgA含量的作用,但作用不顯著(P＞0.05)。輪狀病毒攻毒顯著增加了試驗第15天仔豬腸內容物IgG(P=0.046)、IgA 含量(P=0.042)。25-OH-D3與輪狀病毒的交互作用對試驗期內各階段仔豬腸內容物IgG、IgM、IgA含量都沒有顯著影響(P＞0.05)。

表3 腸內容物IgG、IgM和IgA含量Table 3 IgG,IgM and IgA contents in intestinal contents mg/m L

2.1.3 血清和腸內容物RV-Ab水平

由表4可知,飼糧添加10倍NRC推薦量的25-OH-D3顯著提高了試驗第5、21天仔豬血清(P=0.018,P=0.002)和腸內容物(P=0.005,P=0.045)RV-Ab水平。輪狀病毒攻毒顯著增加了試驗第5、15、21天仔豬血清(P=0.000,P=0.001,P=0.000)和腸內容物(P=0.000,P=0.000,P=0.000)RV-Ab水平。25-OH-D3與輪狀病毒的交互作用對試驗第5、21天仔豬血清(P=0.016、P=0.001)和腸內容物(P=0.010、P=0.009)RV-Ab水平有顯著影響。

表4 血清和腸內容物輪狀病毒抗體水平Table 4 Rotavirus antibody level in serum and intestinal contents IU/m L

2.2 細胞因子

2.2.1 血清細胞因子水平

由表5可知,飼糧添加10倍NRC推薦量的25-OH-D3顯著提高了試驗第5天仔豬血清IL-4水平(P=0.001),對血清 IL-2 、IL-6、IFN-γ水平無顯著影響(P＞0.05)。輪狀病毒攻毒顯著增加了試驗第5天仔豬血清IL-2水平(P=0.009)和第15天血清IL-6水平(P=0.006),對血清IL-4、IFN-γ水平無顯著影響(P＞0.05)。25-OH-D 3與輪狀病毒的交互作用對各階段仔豬血清IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ水平均無顯著影響(P＞0.05)。

2.2.2 腸內容物細胞因子水平

由表6可知,飼糧添加10倍 NRC推薦量的25-OH-D3顯著提高了試驗第15天仔豬腸內容物IL-4水平(P=0.001),顯著降低了第5、15天腸內容物IL-6水平(P=0.013,P=0.022)和第15天腸內容物IFN-γ水平(P=0.030)。輪狀病毒攻毒顯著降低了試驗第15天仔豬腸內容物IL-4水平(P=0.017),對腸內容物 IL-2、IFN-γ、IL-6水平無顯著影響(P＞0.05)。25-OH-D 與輪狀病毒的交互作用對試驗期內各階段仔豬腸內容物IL-2、IL-6、IFN-γ水平均無顯著影響(P＞0.05),但對試驗第15天腸內容物IL-4水平有顯著影響(P=0.047)。

表5 血清細胞因子水平Table 5 Cytokine levels in serum pg/m L

表6 腸內容物細胞因子水平Table 6 Cytokine levels in intestinal contents pg/m L

3 討 論

3.1 飼糧添加25-OH-D3對輪狀病毒攻毒和未攻毒斷奶仔豬血清和腸內容物抗體水平的影響

維生素D3主要調節細胞免疫,但對體液免疫和抗體的分泌也有很強的調節作用。Reinhardt等[13]將1α,25-二羥基維生素D3[1α,25-(OH)2-D3]作為免疫佐劑顯著提高了乳中埃希氏大腸桿菌IgG、IgM、IgA 抗體水平 。Van der Stede等[16]給仔豬肌肉注射1α,25-(OH)2-D3和人血清白蛋白,同樣使特異抗體水平升高。這些研究表明,維生素D3能提高動物抗原特異抗體水平。本試驗結果顯示,飼糧中添加2 200 IU/kg的25-OH-D3顯著提高了斷奶仔豬血清和腸內容物RV-Ab水平,對腸內容物IgG、IgM、IgA的產生也有促進作用,但抑制仔豬血清IgG、IgM、IgA的產生。本試驗中,未攻毒試驗組仔豬血清IgG、IgM、IgA含量在試驗第5天后有低于未攻毒對照組的趨勢;攻毒試驗組仔豬血清IgG、IgM、IgA含量也較攻毒對照組低,只相當于未攻毒對照組水平。上述結果表明,飼糧添加高水平25-OH-D3有降低未攻毒仔豬血清抗體的作用,這與前人的一些報道一致[17-19]。

輪狀病毒感染會提高無菌仔豬體內抗體分泌細胞數量[20-22],從而使仔豬產生大量抗體來對抗病毒感染。本試驗中,攻毒同樣使斷奶仔豬血清RV-Ab水平增加。25-OH-D 3與輪狀病毒的交互作用對血清IgM、IgA含量和 RV-Ab水平有顯著影響,提示25-OH-D3在仔豬遭受輪狀病毒攻毒的強應激條件下作用更明顯。

本試驗中,25-OH-D3降低了斷奶仔豬血清總抗體水平,促進腸內容物總抗體分泌,對仔豬體內血清和腸內容物總抗體表現出不同的作用方式,可能與本試驗采用的從胃腸道系統攻毒的方式有關。黏膜免疫系統對病原體的防御應答主要取決于抗原刺激后功能性淋巴細胞源源不斷由感應部位轉移至效應部位[23],使消除效應更為集中。本試驗中,仔豬接觸病原體和發生免疫反應的部位主要是胃腸道黏膜組織,因此,為了對抗胃腸道受到的病原攻擊,仔豬體內包括外周血的大量淋巴細胞遷移到腸道免疫效應部位,在腸道內產生強烈的免疫應答。

3.2 飼糧添加25-OH-D3對輪狀病毒攻毒和未攻毒斷奶仔豬血清和腸內容物細胞因子水平的影響

IL-2、IFN-γ是 Th1型細胞因子,在 CD4+淋巴細胞參與Th1免疫反應中發揮重要調節作用。IL-4、IL-6是Th2型細胞因子,在CD4+細胞介導的Th2免疫反應中發揮重要調節作用,如促進B細胞產生抗體。輔助T淋巴細胞及其分泌的細胞因子之間有自我加強效應,而分別對其相對立的細胞亞型具有抑制作用[23]。眾多研究都一致發現維生素D3可抑制IL-2[24-26]、IFN-γ的產生[27-28]。維生素D3對IL-4的作用在各種報道中不盡一致,大多數研究發現維生素D3促進IL-4的產生[29-31],但也有研究發現1,25-(OH)2-D3抑制極化的初級鼠CD4+細胞產生IL-4[28]。少量研究報道維生素D3抑制IL-6的產生[32]。

Azevedo等[15]的研究發現,感染輪狀病毒提高了仔豬血清和腸內容物細胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ的水平。本試驗中,輪狀病毒攻毒提高了試驗第5天仔豬血清IL-2、IFN-γ和IL-4水平,第15天血清IL-6水平以及第5天仔豬腸內容物IL-6水平。此結果與 Azevedo等[15]的研究基本一致。本試驗結果顯示,飼糧中添加2 200 IU/kg的25-OH-D3對斷奶仔豬體內細胞因子的影響呈經典的作用模式：提高抗炎癥細胞因子IL-4的水平,降低促炎癥細胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ的水平。上述結果說明25-OH-D 3抑制仔豬Th1型免疫反應,增強Th2型免疫應答。試驗還發現,飼糧添加高水平25-OH-D3降低仔豬腸內容物促炎癥細胞因子的分泌比其對外周血中的促炎癥細胞因子的作用更強烈;同時,25-OH-D3還可提高抗炎癥細胞因子的分泌。

4 結 論

①飼糧添加2 200 IU/kg的25-OH-D3顯著提高了輪狀病毒攻毒斷奶仔豬血清和腸內容物RV-Ab水平,對腸內容物IgG、IgM、IgA的產生也有促進作用,但抑制仔豬血清IgG、IgM、IgA的產生。

②飼糧添加2 200 IU/kg的25-OH-D3可以降低輪狀病毒攻毒和未攻毒斷奶仔豬血清和腸內容物促炎癥細胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ的分泌并抑制其參與的炎癥反應,促進抗炎癥細胞因子IL-4的生成并增強其參與的免疫應答,進而表現出提高斷奶仔豬抗病力的作用。

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